一种抑制成熟破骨细胞骨吸收的药物组合物的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及药物组合物，具体涉及抑制抑制成熟破骨细胞骨吸收的药物组合物。
【背景技术】
[0002] 破骨细胞是骨细胞的一种，来源于骨髓造血干细胞，由单个核前体细胞融合而 成，主要分布在主要分布在骨质表面、骨内血管通道周围，具有骨吸收的功能。成熟破骨细 胞是含有2-50个紧密堆积的核的巨大细胞，具有较强的骨吸收能力，在体外培养的破骨细 胞可以在骨片或象牙表面上形成骨吸收陷窝。
[0003] 破骨细胞是由单个核前体细胞经过增殖、分化、融合和活化的过程，最终形式具有 骨吸收能力的多核的成熟破骨细胞。目前，有很多抑制破骨细胞骨吸收的药物，其分子生物 学机理大部分为抑制破骨细胞的增殖、分化和融合过程。很少有抑制成熟破骨细胞骨吸收 能力的药物。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供一种直接抑制成熟破骨细胞骨吸收能力的药物组合物。
[0005] 本发明的技术方案为如下：
[0006] -种抑制成熟破骨细胞骨吸收的药物组合物，按重量份包括如下组分：维生素 D0. 1-1、熟地 5-20、红花 20-50、葛根 10-30、黄芪 3-10。
[0007] 在优选的技术方案中，所述的成熟破骨细胞骨吸收的药物组合物，按重量份包括 如下组分：维生素 D0. 2-0. 5、熟地10-20、红花35-50、葛根10-20、黄芪3-5。
[0008] 本发明所述抑制成熟破骨细胞骨吸收的药物组合物，用如下方法制备：
[0009] (1)按重量份称取熟地、红花、葛根和黄芪，洗净，将熟地、葛根和黄芪切成厚度为 l-2mm的薄片，备用；
[0010] (2)将步骤（1)中准备好的各原料，混合均匀后，加入2-5倍质量的纯净水煎煮3 次，每次2小时，提取液过滤，合并滤液；
[0011] (3)滤液旋转蒸发水分，的浸膏I ;
[0012] (4)浸膏I用2-10倍量的乙醇溶解，冷藏过夜，过滤，滤液减压回收乙醇，得浸 膏II ;
[0013] (5)浸膏II冷冻干燥，得粉末状药物组分；
[0014] (6)步骤（5)的药物组分，加入所述重量份的维生素 D，混合均匀，UV杀菌，分装，即 可。
[0015] 本发明还提供所述药物组合物在制备预防和治疗骨丢失性疾病的药物中的应用。
[0016] 本发明所述药物组合物，对成熟破骨细胞具有很好的骨吸收抑制作用，来源于天 然药物，副作用少，具有使用安全的特点。
【具体实施方式】
[0017] 下述非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以 任何方式限制本发明。实施例中所述试验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和 材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得，或可以常规方法制备。
[0018] 实施例1本发明药物组合物的制备
[0019] (1)分别称取15g熟地、30g红花、20g葛根和5g黄芪，洗净，将熟地、葛根和黄芪切 成厚度为l-2mm的薄片，备用；
[0020] (2)将步骤（1)中准备好的各原料，混合均匀后，加入3倍量的纯净水煎煮3次，每 次2小时，提取液过滤，合并滤液；
[0021] (3)滤液在65°C旋转蒸发水分，的浸膏I ;
[0022] (4)浸膏I用5倍量的乙醇溶解，冷藏过夜，过滤，滤液减压回收乙醇，得浸膏 II ；
[0023] (5)浸膏II冷冻干燥，得粉末状药物组分；
[0024] (6)步骤（5)的药物组分，加入0· 5g维生素 D，混合均匀，UV杀菌，分装，即可。
[0025] 实施例2药物组合物活性检测
[0026] (1)破骨细胞的培养：取4周龄的SD雄性大鼠，麻醉后托颈处死，放在75%乙醇中 浸泡片刻，在无菌条件下，取出大鼠大腿骨和胫骨，去净骨表面的软组织，用无菌PBS反复 冲洗2-3次，最后置于含有15%胎牛血清的DMEM培养液中，剪断大腿骨和胫骨的两端，并用 注射器取吸取含15%胎牛血清的DMEM培养液，反复冲洗骨髓细胞，直至骨头发白。将冲洗 的骨髓细胞收集于50ml离心管中，在1000rpm，4°C下离心10分钟，去上清液。再加入DMEM 培养液，将离心管内的细胞均匀悬浮于培养液中，再离心，去上清液，反复洗2-3次。最后加 入适量含有15%胎牛血清的DMEM培养液吹打均匀，上葡聚糖凝胶S印hadex GlO色谱柱， 用含有15%胎牛血清的DMEM培养液，收集洗脱液中的细胞，1000rpm，4°C下离心10分钟， 去上清液。细胞中加入适量培养培养液，并加入含有la，25(0H) 2D3 (VD3)、破骨细胞生成因 子（RANKL)和巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF)的15%胎牛血清的DMEM，其中VD 3、RANKL和 M-CSF的最终浓度分别为l(T8M、50ng/ml、20ng/ml。加入细胞因子的细胞种于24孔板中，每 孔中的细胞数IX IO6个细胞，在37°C，5%C02培养箱培养。每两天换液一次，共培养4天。
[0027] (2)象牙片的准备：将直径约3. 7mm，厚度约2. 7 μ m的象牙片，用75%乙醇浸泡5 个小时，用无血清的DMEM反复冲洗后，在紫外灯下放置12小时以上。将消毒处理后的象牙 片平铺于96孔板中，备用。
[0028] (3)药物组合物对成熟破骨细胞骨吸收活性的影响：步骤（1)中，培养4天的细胞， 轻轻吸取培养上清液后加入0. 05%胰蛋白酶-0. 02%EDTA0. 5ml，联合消化培养板中的细胞 5min，加入0. 5ml/孔含15%胎牛血清的DMEM培养液终止胰蛋白酶的消化作用。将消化下 来的细胞收集于离心管中，在lOOOrpm，4°C下离心5分钟，去上清液。然后迅速加入含15% 胎牛血清的DMEM培养液，均匀悬浮细胞，将细胞轻轻加入到步骤（1)中的铺有象牙片的96 孔板中，细胞数为2 X IO5个/孔。将实施例1制备的药物组合物溶于DMEM培养液中，配制 成一定浓度，然后加入到上述铺有象牙片和破骨细胞的培养体系中，药物组合物培养体系 中的最终浓度分别为 l〇〇ug/ml、10ug/ml、3ug/ml、lug/ml、0· lug/ml、0· 0lug/ml，各浓度设 4个平行孔，结果取平均值；未加入药物的组作为对照组。加入药物组合物后，在37°C，5%C0 2 培养箱中培养，每2. 5天换液。培养5天后，弃去培养上清液，2%TRIT0N X-IOO固定lOmin， 于0· 25mol/L氢氧化铵中超声波清洗3次，每次5min，依次在50%乙醇，60%乙醇，70%乙 醇，80%乙醇，90%乙醇，95%乙醇，100乙醇和无水乙醇中梯度脱水后，1%甲苯胺蓝染液中染 色1-2分钟，蒸馏水清洗3次，在显微镜下观察吸收陷窝，并计数，结果如表1。陷窝面积用 Scion Image version Beta4. 02software 计算，结果如表 I 〇 [0029] 表1.药物组合物对成熟破骨细胞象牙片骨吸收的影响
【主权项】
1. 一种抑制成熟破骨细胞骨吸收的药物组合物，其特征在于，按重量份包括如下组分： 维生素 DO. 1-1、熟地5-20、红花20-50、葛根10-30、黄芪3-10。
2. 根据权利要求1所述的成熟破骨细胞骨吸收的药物组合物，其特征在于，按重量份 包括如下组分：维生素 D0. 2-0. 5、熟地10-20、红花35-50、葛根10-20、黄芪3-5。
【专利摘要】本发明提供了一种抑制成熟破骨细胞骨吸收的药物组合物，其特征在于，按重量份包括如下组分：维生素D0.1-1、熟地5-20、红花20-50、葛根10-30、黄芪3-10。本发明的药物组合物，其制备方法简单，对成熟破骨细胞具有很好的骨吸收抑制作用，来源于天然药物，副作用少，具有使用安全的特点。
【IPC分类】A61K36-804, A61P19-08, A61K31-59
【公开号】CN104547231
【申请号】CN201310508856
【发明人】秦宏佳
【申请人】大连市沙河口区中小微企业服务中心
【公开日】2015年4月29日
【申请日】2013年10月21日