用于制造具有活细胞的水凝胶微粒的方法和用于制造组织工程支架的组合物的制作方法
【专利说明】用于制造具有活细胞的水凝胶微粒的方法和用于制造组织 工程支架的组合物
[0001] 相关申请的引用
[0002] 本申请要求于2012年8月8日提交的美国临时申请61/680, 854的权益，出于所 有目的将其全部内容通过引用合并于此。
技术领域
[0003] 本申请设及水凝胶微粒W及水凝胶微粒在形成可用于代替组织（例如器官、骨或 其部分）的组织工程支架的应用的领域。
【背景技术】
[0004] 由于微球提供了移植的微创方式，其已被用作药物和细胞的递送载体。尤其是，由 于W下优点已经开发了用于再生医学目的细胞递送的许多材料和制造方法；在受控尺寸的 微球中大规模培养细胞的简便性、为细胞提供可调节的=维（3-D)环境、结合生化信号和 生物力学部分的能力W及将负载细胞的微球直接注射到缺陷部位而不存在膜蛋白酶化的 简便性。
[0005] 通常通过两步法来进行研究，首先制造微球，例如通过单乳法或复乳法、电喷雾和 热诱导的相分离W及随后将细胞接种于所述微球上。尽管上述方法能够支持细胞，但微球 制造技术通常需要专用设备或大量的时间，因为在化学处理之后彻底的清洗步骤是必需 的。
[0006] 而且，该些技术在很大程度上满足了贴壁依赖性细胞（例如成纤维细胞）的需要。 一些其他的研究小组报道了利用合成的聚己二醇二丙締酸醋或天然生物聚合物直接将细 胞封装到微球中的技术，其中利用合成的聚己二醇二丙締酸醋需要表面修饰并添加酶降解 位点，天然生物聚合物（例如藻酸盐）的每个批次不同且具有不受控的降解速率。
[0007] 组织工程学技术通常需要使用临时支架作为初始细胞附着W及随后组织形成的 =维模板。支架能够被身体代谢，该使得其逐渐被新的细胞替代而形成功能性组织。如此， 支架设计是组织工程学中最重要的方面之一。
[000引水凝胶由于其类似于组织的含水量、良好的生物相容性W及用于原位移植的可注 射进入性（inject油le accessibility)而显出作为组织工程支架的巨大潜力。然而，在将 水凝胶用作支架和细胞递送材料中还存在实质性挑战。例如，水凝胶具有低细胞亲和性。因 此，当其被用于封装再生医学中常用的细胞（例如，成纤维细胞、成骨细胞、内皮细胞、上皮 细胞和平滑肌细胞）时，该些贴壁依赖性细胞（ADC)不能在水凝胶框架中分散而是被束缚 在球体形状中，从而导致较差的固定并且经常会发生细胞死亡。另外，细胞在水凝胶本体中 的球形约束防止了细胞迁移和细胞间相互作用，而该对于介导细胞分化和组织再生是至关 重要的，同时球形约束也防止了对细胞聚集的抑制，而该种抑制对于组织（例如软骨和肝） 的再造是尤其必需的。
[0009] 肝是人体内最大的内部器官，负责大量的基本功能，例如解毒和蛋白质合成。醜酒 和例如肝炎的疾病引起最为急性或慢性的肝衰竭。目前，世界上有数w百万计的人患有该 种疾病，但由于肝供体的严重短缺，只有少部分人接受了肝移植。另外，接受了成功肝移植 的患者并不一定能完全康复。他们具有免疫排斥的风险并且终生依赖于免疫抑制药物。肝 病的患病率增加已促使研究人员寻找替代疗法，例如作为可能的解决方案的肝细胞移植； 该些在过去十年中已被广泛开发。
[0010] 肝细胞移植依赖于将成熟肝细胞或肝脏干细胞引入到宿主中W修复、保持或改善 有缺陷的肝功能。成熟的肝细胞在体外的增殖能力不理想并且其在二维单层培养物中会迅 速失去其表型。尽管肝细胞移植可具有直接疗效，但其临床应用受到细胞可用性和质量的 限制。研究已报道了当肝细胞团块或球体形成时在=维培养物中对肝特异性的功能性的保 持。从该个意义上讲，产生具有可控尺寸和形状的肝细胞球状体提出了肝组织工程研究和 开发中的关键挑战之一。
[0011] 已经开发了多种不同的方法来辅助形成该些球体。常用的方法包括利用生物反应 器、光刻法或微图形化W产生合适尺寸的模型。但是，该些方法需要专用设备，W产生可控 尺寸的球体并且在扩大规模方面面临相当大的困难。
[0012] 从上文中可看出，仍然存在对形成水凝胶微粒的方法的需求，该方法可在用于制 造组织工程支架的组合物中使用，并且解决上述问题中的一种或多种。
【发明内容】
[0013] 在第一个方面。本发明设及制造包含附着在其上和/或封装在其中的一种或多种 活细胞的水凝胶微粒的方法。该方法包括
[0014] a)将水凝胶形成剂溶解于水性介质中W形成溶液；
[0015] b)将一种或多种活细胞悬浮于该溶液中W形成细胞悬浮液；
[0016] C)将该细胞悬浮液分散于有机油中W形成微乳液；W及
[0017] d)使该微乳液经历使水凝胶形成剂能够形成包含附着在其上和/或封装在其中 的一种或多种活细胞的水凝胶微粒的条件。
[001引在第二个方面，本发明设及包含可降解的水凝胶和根据本发明第一个方面的包含 附着在其上和/或封装在其中的一种或多种活细胞的至少一种水凝胶微粒的混合物的组 合物。
[0019] 在第=个方面，本发明设及可降解的水凝胶和包含附着在其上和/或封装在其中 的一种或多种活细胞的至少一种水凝胶微粒的混合物的组合物，其中至少一种可降解的水 凝胶和水凝胶微粒包含影响该水凝胶微粒降解的致孔剂。
[0020] 在第四个方面，本发明设及制造组织工程支架的方法。该方法包括
[0021] a)提供包含可降解的水凝胶和包含附着在其上和/或封装在其中的一种或多种 活细胞的至少一种水凝胶微粒的混合物的组合物；
[0022] b)在使该一种或多种活细胞能够增殖并且至少一种水凝胶微粒在可降解的水凝 胶中降解W使得一种或多种活细胞增殖W及使得至少一种水凝胶微粒降解的条件下培养 该组合物；W及
[0023] C)降解该经培养的混合物的所述可降解的水凝胶W获得支架。
【附图说明】
[0024] 当结合非限制性实例和附图时，参照详细描述将能够更好地理解本发明，其中：
[002引图1(A)至图1似为tDGMC和构建体的制造方法的示意图。在图1(A)中描绘了 tDGMC的制造方法。将悬浮在37°C的明胶A型溶液中的软骨细胞加入到37°C豆油的烧杯 中，并在冰水浴中揽拌。将tDGMC-油乳液离屯、，然后用lx PBS清洗两次。随后除去PBS上 清液。在炬）中，描述了 PTCC-tDGMC和化CG-tDGMC的制造过程。将软骨细胞在藻酸盐中的 悬浮液加入到tDGMC中（0.30g ml4藻酸盐）。然后将充分混合的悬浮液转移至娃胶模具， 并通过加入氯化巧溶液完成藻酸盐凝胶化W形成PTCC-tDGMC。在37°C下解育后，明胶完全 溶解，并且在2天后形成腔室。悬浮于腔中的细胞增殖为细胞岛（cell islet),同时来自藻 酸盐凝胶本体的细胞渗入腔中。由软骨细胞和其分泌的ECM构成的新组织填满孔并融合在 一起。在培养中，在21天后通过经由巧樣酸钢（SC)处理PTCC-tDGMC构建体W除去藻酸盐 来获得化CG-tDGMC。在（C)中，描述了根据现有技术方法的PTCC-WkMC和化CG-WkMC制 造方法。将软骨细胞和空白明胶微球在藻酸盐中的悬浮液转移到娃胶模具中；如上所述进 行凝胶化。来自藻酸盐本体的细胞渗入被明胶微球留下的腔中，并发育了新组织。在培养 35天后，通过SC处理除去藻酸盐，W产生无支架3-D化CG-WkMC。
[0026] 图2为示出了基于20个随机亮视野显微镜图像的tDGMC尺寸分布的图示。Y-轴： tDGMC的数目；X-轴；直径（y m)。
[0027] 图3示出了封装在blkGEktDGMC中的细胞的活性测试。在（A)中，示出了在不同 时间点的4x放大的tDGMC构建体的活/死染色和对应的亮视野显微镜图像。比例尺代表 500 ym并且适用于所有图像。炬）示出了根据构建体干重归一化的细胞密度的图示，其基 于利用化echst 33258测试的DNA定量分析。Y-轴：细胞密度（X lOYmg干重）；x-轴：时 间（天）。
[002引图4为示出了通过WST-1测试的细胞活性评价的图示。*表示p<0. 05 ;观察到构 建体之间的统计学显著性差异。
[0029] 图5示出了各种软骨细胞标记物表达的分析图示（A)2型胶原蛋白；炬)1型胶原 蛋白；似聚集蛋白聚糖（Aggrecan);值)Sox9 ;似COMP ;(巧化oA ;佑）（i)PTCC-WkMC的整 合素0 1 ; (ii)PTCC-tDGMC的整合素0 1 ;和（iiDliiCG-tDGMC的整合素0 1。Y-轴；倍数； X-轴；时间（天）。基于在第0天PTCC-blkMC构建体中特定基因的表达值来计算每种基因 的倍数值。*表示P<〇. 05 ;观察到构建体之间的统计学显著性差异。
[0030] 图6为示出了 GAG和胶原蛋白含量相对与时间（天）作图的生物化学分析的图示， 其中（A)和炬）；每个细胞的GAG和胶原蛋白；(C)和值）；根据干重归一化的GAG和胶原蛋 白。*表明p<〇. 05 ;观察到构建体之间的统计学显著性差异。
[0031] 图7示出了 W lOx放大比较PTCC-WkMC和化CG-tDGMC构建体的各种组织化学和 免疫组织化学染色：(A)H&E染色；炬）马松S色染色；（C)番红0染色；值)2型胶原蛋白的 免疫组织化学染色；和巧)1型胶原蛋白的免疫组织化学染色。在所有的免疫组织化学图像 中，细胞核被染成藍色值API)。比例尺代表200 ym并且适用于全部图像。
[003引图8(A)示出了负载细胞的微球水凝胶复合构建体（对照、匪和MG)的制造步骤 的示意图；插图为10倍放大；炬）经过或未经过MMP-9处理的对照、匪和MG构建体的相衬 像。比例尺代表100 ym的长度。
[003引图9示出了在不同浓度的京巧平（0. lwt%、0. 25wt%和0. 5wt% )中交联之后的 明胶微球的总图。第一柱：在PBS溶液中溶胀之后的京巧平交联的微球。交联度的近似值 由所形成的藍色颜料的强度表示。第二柱：在37°C下在PBS中解育30分钟的京巧平交联 的微球。第S柱：在37°C下在含有100 y g mri的MMP-9的培养基中解育京巧平微球4小 时。比例尺代表100 ym的长度。
[0034] 图10是示出了利用WST-1测试进行的在对照、匪和MG构建体中细胞增殖情况的 图示。*代表P<〇. 05,当与该天的对照样品相比较时。Y-轴：吸光度；X-轴；时间（天）。 [003引 图11示出了在第4、7和17天，对照、匪和MG构建体中的细胞的活/死染色和相 衬像。比例尺表示100 ym的长度。
[0036] 图12示出了在不同时间点的对照、匪和MG构建体的白蛋白和细胞色素 P4501AUCYP1A1)的基因表达。*代表当与该天对照样品相比较时p<0.05。Y-轴；基因表 达（2-act) ;x-轴：时间（天）。
[0037] 图13为示出了在不同的时间点的对照、匪和MG构建体的白蛋白分泌的图示。* 代表当与该天对照样品相比较时P<〇. 05。Y-轴；归一化的白蛋白；X-轴；时间（天）。
[003引图14示出了在裸鼠中进行皮下移植14天后，对照、匪和MG构建体的组织化学染 色。红色虚线表示腔，而白色箭头代表构建体中的化pG2细胞团块。比例尺表示lOOym的 长度。
[0039] 图15示出了在第21天用巧樣酸钢溶液处理后的构建体的照片。左侧；LhCG-WkMC 和右侧ihCG-tDGMC。保留了完整的liiCG-tDGMC构建体，但对于部分崩塌的liiCG-WkMC构 建体而言则不太明显。红色箭头代表碎片。
【具体实施方式】
[0040] 在第一个方面，本发明设及制造包含附着在其上和/或封装在其中的一种或多种 活细胞的水凝胶微粒的方法。
[0041] 有利地，该制造水凝胶微粒的方法允许在水凝胶微粒中负载具有高细胞活性的细 胞。该具有附着在其上和/或封装在其中的一种或多种活细胞的水凝胶微粒可由可降解 的水凝胶形成，并