语"趋化因子"是指引起细胞积聚的物质，例如趋 化因子、单核细胞趋化蛋白-1和半乳凝素-3。术语"激素"是指由不同的内分泌腺产生的 痕量物质，其起到被血液带到不同祀器官的化学信使的作用，其调节脊椎动物中的各种生 理和代谢活动。激素的实例包括酱体雌激素、孕酬、雄激素和孕激素黄体酬。类固醇也可W 被分类为脂质。W非常低浓度存在的天然存在的类固醇为动物发育和代谢的重要调节剂。 类固醇的实例包括胆固醇、可的松W及雌激素和黄体酬的衍生物。如本文中使用的，术语" 细胞粘附分子"包括，但不限于，纤连蛋白、玻璃粘连蛋白、I型胶原蛋白、骨桥蛋白、骨诞蛋 白、凝血酶敏感蛋白和纤维蛋白原。该些分子对于贴壁依赖性细胞的附着是很重要的。
[0107] 在第四个方面，本发明设及制造组织工程支架的方法。
[010引如本文中使用的，术语"支架"是指彼此联通的孔的高孔隙率、人造的；维网络，其 在体内被用作支架，额外的细胞可附着于其上并且现有的和额外的细胞可W生长W使得由 于损伤或疾病而丧失的组织再生。术语"活支架"是指可由活细胞或通过活细胞形成的支 架。可通过本文中所述的物理键合或化学键合将一种或多种活细胞附着于支架。可允许活 细胞在一段时间内增殖，其中该些细胞可W生长W形成群落，之后该群落可W融合W形成 细胞的网络，并随后形成活支架。
[0109] 通常，增殖的时间可在几小时或几天至几周的范围内，例如约1天至约4周或约1 天至约2周或约1天至约1周。增殖的时间也可W取决于细胞的培养条件。培养条件的参 数可W包括，例如，温度、pH、水量、压力、存在的营养物质W及细胞的类型。例如，公知真核 哺乳动物细胞的生长通常比例如原核细菌细胞要慢得多。细胞的培养条件是本领域已知的 并且因此本领域技术人员可根据期望的细胞类型和应用来采用。
[0110] 该方法包括，提供包含可降解的水凝胶和包含附着在其上和/或封装在其中的一 种或多种活细胞的至少一种水凝胶微粒的混合物的组合物。上文中已经描述了可W使用的 可降解的水凝胶、水凝胶微粒和活细胞的实例。
[0111] 在各种实施方式中，可降解的水凝胶包含一种或多种活细胞。在允许一种或多种 活细胞在可降解的水凝胶中增殖并且至少一种水凝胶微粒在可降解的水凝胶中降解的条 件下培养该组合物，W允许存在于水凝胶微粒或水凝胶微粒和可降解的水凝胶中的一种或 多种活细胞增殖，并允许至少一种水凝胶微粒降解。该方法还包括降解所培养混合物的可 降解的水凝胶W获得支架。
[0112] 包含水凝胶微粒和可降解的水凝胶的组合物可W自然降解。术语"自然降解"是 指将组合物置于预期应用的环境中W使得水凝胶降解。该组合物也可W利用本文中所述的 降解方式之一被人工降解。可W调节水凝胶微粒和可降解的水凝胶的降解速率W匹配细胞 增殖的速率。例如，水凝胶微粒可W相比于可降解的水凝胶的降解速率更快的速率降解，二 者可W均比细胞增殖速率要快，W使得细胞可具有足够的生长空间。随后，可降解的水凝胶 中的腔可W物理引导和适应新组织在腔内的生长。该新组织可最终填充腔并且最终在可降 解的水凝胶中融合在一起。
[0113] 在各种实施方式中，水凝胶微粒和可降解的水凝胶中的至少一种包含影响水凝胶 微粒降解的致孔剂。上文中已经描述了适合的致孔剂的实例。
[0114] 水凝胶的特征在于高渗透性，W用于交换细胞增殖必需的营养物质，且水凝胶的 物理性质类似于天然组织。如上文中所述，根据用于移植的组织或器官的类型，可W向水凝 胶微粒和/或可降解的水凝胶中加入不同种类的活细胞。术语"组织"是指由连接在一起 的相关细胞形成的结构，其中细胞共同作用W完成特定的功能。器官是指由各种细胞或组 织构成并且适应于特定功能的有机体的分化结构。因此，可向组合物中加入一种或多种活 细胞或者组合物中可包含一种或多种活细胞W形成特定的器官。例如，屯、脏是一种器官，其 含有用于累送血液的肌肉组织、构成屯、脏瓣膜的纤维组织和维持屯、率和屯、跳节律的特殊细 胞（special cells)。
[0115] 根据第四个方面的支架可被广泛用于多种应用，例如组织工程。例如，其可被用于 自体细胞的=维扩增，如骨髓间充质干细胞，其由于供区并发症而受到限制。用于该样的应 用的宿主可W是任何适合的动物。在进一步的实施方式中，所述宿主为哺乳动物或人类患 者。
[0116] 根据第四个方面的支架也可W作为基质用于移植，例如，解离的细胞（例如软骨 细胞或肝细胞），W产生=维组织或器官。可将任意类型的细胞加入到支架中用于进行培养 和可能的移植，包括肌肉和骨骼系统的细胞，例如软骨细胞、成纤维细胞、肌肉细胞和骨细 胞、实质细胞例如肝细胞、膜腺细胞（包括膜岛细胞）、肠源性细胞和其他细胞例如神经细 胞和皮肤细胞，不论是由供体获得的、由构建的细胞培养物系或甚至在基因工程之前或之 后获得的。也可W使用组织的切片，其可W在同一结构中提供一些不同的细胞类型。支架 也可W被用作用于贴壁依赖性细胞的立维体外培养系统，例如更近似地模仿生理学微环境 的=维微环境中的肝细胞。
[0117] 下文中，将参照附图更全面地描述本发明，其中示出了本发明的示例性实施方式。 然而，本发明可W许多不同的形式实施，而不应被解释为限于本文中所述的示例性实施方 式。而提供该些实施方式是为了使本公开全面和完整，并向本领域技术人员全面解释本发 明的范围。在附图中，出于清楚的目的，可能扩大了层和区域的长度和尺寸。
[0118] 如本文中使用的，术语"和/或"包括一个或多个相关所列事项中的任一种或全部 组合。应该理解，尽管术语第一、第二、第=等等在本文中可被用于描述各种元素、组分、区 域、层和/或部分，但该些元素、组分、区域、层和/或部分不应限于该些术语。使用该些术 语仅仅是为了将一种元素、组分、区域、层或部分与其他的区域、层或部分相区分。因此，W 下所讨论的第一元素、组分、区域、层或部分能够被称为第二元素、组分、区域、层或部分，而 不背离本发明的教导。
[0119] 本文中所使用的术语仅仅是出于描述特定实施方式的目的，而不是意在限制本发 明。除非上下文中明确指出，如本文中使用的，单数形式"一个（a)"、" 一种（an)"和"该 (the)"旨在也包括复数形式。还应该理解，当本发明说明书中使用术语"包含（comprises)" 和/或"包含（comprising)"时，表明所述特征、整数、步骤、操作、元素和/或组分的存在， 而不是排除存在或加入一种或多种其他的特征、整数、步骤、操作、元素、组分和/或它们的 组。
[0120] 除非另外定义，本文中使用的所有的术语（包括技术和科学术语）与本发明所属 领域的普通技术人员的通常理解具有相同的涵义。应该进一步理解，该些术语（例如在那 些常用字典中的定义）应该被解释为具有与其在相关领域的情境中的涵义相一致的涵义， 而不应被解释为理想化的或过度的字面涵义，除非本文中明确如此定义。
[0121] 本文中示例性描述的本发明可W适合于不存在本文中未具体披露的任何一种或 多种元素、一种或多种限制的情况下实施。因此，例如，术语"包含"、"包括"、"含有"等 应被广义理解而不是进行限制。另外，本文中采用的术语和表达被用作说明的术语，而非限 审IJ，并且并不旨在使用该样的术语和表达来排除其所示出或描述或其部分的特征的等同方 式，但应该认识到，各种修改方式均可包括在本发明所要求保护的范围内。因此，应该理解， 尽管已经通过优选的实施方式和可选特征具体描述了本发明，但本领域技术人员可采用实 现本文的实施方式中披露的本发明的变化和改变，并且该样的变化和改变被认为是包括在 本发明的范围内。
[0122] 本文中已经广泛并从总体上描述了本发明。落入总体披露内容中的每一较窄种类 和下位组也构成本发明的一部分。该包括了从种属中排除了任何主题的附条件的或消极限 制的对本发明的总体描述，而与本文中是否具体提到了所测试的材料无关。
[0123] 其他的实施方式也包括在所附权利要求和非限制性实施例中。另外，当W马库什 组来描述本发明的特征或方面时，本领域技术人员将认识到，本发明也W马库什组的单个 成员或成员亚组的方式来进行描述。
[0124] 实验部分
[0125] 一方面，已经开发和研究了封装负载细胞的微球的水凝胶形式的治疗性细胞递送 方法。在示例性实施方式中，作为软骨组织工程的模型细胞，在低温且无任何化学处理的条 件下，在经由油包水单一乳化过程形成微球的过程中，成功地将具有高细胞活性的软骨细 胞封装在明胶类微球（大多数直径为50 y m至100 y m，中值为75 y m至100 y m)中。然后 将该些负载细胞的微球封装在藻酸盐类水凝胶构建体中。通过升温至37°C使负载细胞的 微球在2天内完全溶解，得到水凝胶本体中的相同数量的相同尺寸球形腔，同时被封装的 细胞从微球中释放并悬浮于该腔内，W待培养，从而用于进一步发育。在该种细胞递送系统 中，微球起到作为可去除的细胞载体和用于产生水凝胶内腔的双重作用，其中被递送的细 胞具有自由生活空间和更好的可渗透环境。通过WST-1、定量聚合酶链反应、生物化学测试 和各种免疫组织化学和组织学染色来测试和评价该种与负载细胞的水凝胶支架相关的由 温度固化的可溶性明胶微球类细胞载体（tDGMC)。结果表明，tDGMC技术能够促进作为非贴 壁治疗性细胞的软骨细胞的递送，具有显著更好的效率。
[0126] 在另一方面，根据各种实施方式开发了将可降解的微球用作细胞载体且使用致孔 剂在藻酸盐水凝胶构建体本体中产生腔用于可控尺寸的肝细胞球体发育的平台。
[0127] 在示例性实施方式中，首先将细胞接种于京巧平交联的微球上并将该些负载细胞 的微球封装在藻酸盐水凝胶中。在凝胶化之后，通过引入胶原酶（MMP9)使微球崩解W在凝 胶本体中制造腔；所负载的细胞悬浮并被捕获于该些腔中，为球体形成提供空间，同时藻酸 盐本体起到约束的作用W将所产生的球体尺寸限定在一定范围内。
[0128] 根据各种实施方式的方法是有利的，因为整个组织机构简单且不需要任何专用设 备。此外，其是经济的且便于扩大规模。尤其是在其中使用藻酸盐作为水凝胶本体的实施 方式中，能够通过巧樣酸钢处理从藻酸盐凝胶本体中回收细胞球体。在多糖水凝胶中，藻酸 盐是具有用于细胞回收的该种独特性质的唯一凝胶系统。因此，能够获得无支架的细胞团 块W用于进一步分析或随后的研究。
[012W 连施例1. 1 :tDGMC的制推巧尺寸表佈
[0130] 通过将0. 50g明胶（来自猪皮的A型明胶；Sigma)溶解于10ml由5ml磯酸盐缓冲 盐水（PB巧和5ml软骨细胞培养基（CC培养基）组成的溶液中来制备明胶溶液巧％ w/v)。 CC培养基的组成如下；含有20%v/v FBS Gold佑ibco)、0.4mM脯氨酸、0.01M的4-(2-哲 己基）-嗽嗦-1-己横酸、0. ImM非必需氨基酸、0. 05mg ml-i维生素C、lOOmg ml-1链霉素和 100 单位 mri青霉素的 DMEM Glutamax(Gibco)。
[0131] W IX 1〇7细胞ml ^明胶的浓度将第1代猪软骨细胞悬浮于37°C明胶溶液中。将 悬浮液加入到含有15ml豆油（过滤并预热至37°C )的50ml烧杯中，并在室温下W 50化pm 揽拌2分钟。然后将烧杯转移至冰水浴中并W 30化pm揽拌10分钟。将乳液W 70化pm离 屯、3分钟。在除去上清液后，将其中封装有软骨细胞（tDGMC)的明胶微球沉淀（即tDGMC) 再悬浮于15ml的4°C lx PBS中W用于清洗。将悬浮液W 70化pm离屯、3分钟并再次清洗。
[0132] 图1A中示出了在无菌条件下进行的程序的简单示意图。表1中给出了在样品命 名中使用简称列表。
[0133] 表1 ;所使用的简称列表
[0134]
【主权项】
1. 制造水凝胶微粒的方法，所述水凝胶微粒包含附着在其上和/或封装在其中的一种 或多种活细胞，所述方法包含： a) 将水凝胶形成剂溶解于水性介质中以形成溶液； b) 将一种或多种活细胞悬浮于所述溶液中以形成细胞悬浮液； c) 将所述细胞悬浮液分散于有机油中以形成微乳液；以及 d) 使所述微乳液经历