允许所述水凝胶形成剂形成水凝胶微粒的条件，所述水凝胶微粒 包含附着在其上和/或封装在其中的一种或多种活细胞。
2. 根据权利要求1所述的方法，其中，所述水凝胶形成剂包含可物理交联聚合物、可化 学交联聚合物或它们的混合物。
3. 根据权利要求2所述的方法，其中，所述可物理交联聚合物选自由明胶、藻酸盐、果 胶、红藻胶、鹿角菜胶、壳聚糖、它们的衍生物、它们的共聚物以及它们的混合物组成的组 中。
4. 根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中，所述水凝胶形成剂包含明胶或主要 由明胶组成。
5. 根据权利要求2所述的方法，其中，所述可化学交联聚合物选自由淀粉、结冷胶、葡 聚糖、透明质酸、聚（环氧乙烯）、聚膦腈、它们的衍生物、它们的共聚物以及它们的混合物 组成的组中。
6. 根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中，所述溶液中的水凝胶形成剂的量为 约 1% (w/v)至约 10% (w/v)。
7. 根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中，所述溶液中的水凝胶形成剂的量为 约 5 % (w/v)。
8. 根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中，所述活细胞为真核细胞或原核细胞 或古生菌。
9. 根据权利要求8所述的方法，其中，所述真核细胞为非贴壁依赖性细胞。
10. 根据权利要求9所述的方法，其中，所述非贴壁依赖性细胞选自由软骨细胞、胚胎 干细胞、成体干细胞、内胚层谱系细胞和用于再生医学的癌细胞组成的组中。
11. 根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中，所述活细胞包含软骨细胞或主要 由软骨细胞组成。
12. 根据权利要求8所述的方法，其中，所述真核细胞为贴壁依赖性细胞。
13. 根据权利要求12所述的方法，其中，所述贴壁依赖性细胞选自由成骨细胞、成纤维 细胞、表皮细胞、脂肪细胞、神经细胞、内皮细胞、上皮细胞、角化细胞、肝细胞、肌细胞、来自 关节韧带的细胞以及来自髓核的细胞组成的组中。
14. 根据权利要求1至13中任一项所述的方法，其中，所述有机油选自由豆油、玉米油、 葵花籽油、油菜籽油、棉籽油、花生油、橄榄油、芝麻籽油、大米胚芽油、鱼油、鲸油、棕榈油、 椰子油、大麻籽油、菜籽油、麦胚油、红花油、亚麻籽油、桐油、蓖麻油和它们的混合物组成的 组中。
15. 根据权利要求1至14中任一项所述的方法，其中，所述有机油包含豆油或主要由豆 油组成。
16. 根据权利要求1至15中任一项所述的方法，其中，将所述水凝胶形成剂溶解于所述 水性介质中是在约20°C至约45°C范围内的温度下进行的。
17. 根据权利要求1至16中任一项所述的方法，其中，将所述水凝胶形成剂溶解于所述 水性介质中是在约37°C的温度下进行的。
18. 根据权利要求1至17中任一项所述的方法，其中，将所述细胞悬浮液分散于所述有 机油中是在持续搅拌下进行的。
19. 根据权利要求1至18中任一项所述的方法，其中，使所述微乳液经历允许所述水凝 胶形成剂形成水凝胶微粒的条件包含在约〇°C至约10°C范围内的温度下冷却所述微乳液。
20. 根据权利要求1至19中任一项所述的方法，进一步包含在所述水凝胶微粒形成之 后提取所述有机油。
21. 根据权利要求20所述的方法，进一步包含在提取所述有机油之后的至少一个离心 步骤和至少一个清洗步骤。
22. -种组合物，所述组合物包含可降解的水凝胶和至少一种如权利要求1至21中任 一项所限定的水凝胶微粒的混合物，所述水凝胶微粒包含附着在其上和/或封装在其中的 一种或多种活细胞。
23. -种组合物，所述组合物包含可降解的水凝胶和至少一种水凝胶微粒的混合物，所 述水凝胶微粒包含附着在其上和/或封装在其中的一种或多种活细胞，其中，所述可降解 的水凝胶和所述水凝胶微粒中的至少一种包含影响所述水凝胶微粒降解的致孔剂。
24. 根据权利要求23所述的组合物，其中，所述致孔剂包含酶或主要由酶组成。
25. 根据权利要求23或24所述的组合物，其中，所述致孔剂选自由胶原酶、蛋白酶、糖 苷酶、链霉蛋白酶、酪蛋白酶、软骨素酶、皮肤素酶、弹性蛋白酶、明胶酶、肝素酶、透明质酸 酶、角蛋白酶、脂肪酶、金属蛋白酶、葡激酶、链激酶、糜蛋白酶、肽链内切酶V8、胰蛋白酶、嗜 热菌蛋白酶、胃蛋白酶、血纤维蛋白溶酶和它们的组合组成的组中。
26. 根据权利要求23至25中任一项所述的组合物，其中，所述致孔剂包含胶原酶或主 要由胶原酶组成。
27. 根据权利要求23至26中任一项所述的组合物，其中，所述可降解的水凝胶包含一 种或多种活细胞。
28. 根据权利要求27所述的组合物，其中，所述活细胞为真核细胞或原核细胞或古生 菌。
29. 根据权利要求28所述的组合物，其中，所述真核细胞为非贴壁依赖性细胞。
30. 根据权利要求29所述的组合物，其中，所述非贴壁依赖性细胞选自由软骨细胞、胚 胎干细胞、成体干细胞、内胚层谱系细胞和用于再生医学的癌细胞组成的组中。
31. 根据权利要求23至30中任一项所述的组合物，其中，所述活细胞包含软骨细胞或 主要由软骨细胞组成。
32. 根据权利要求28所述的组合物，其中，所述真核细胞为贴壁依赖性细胞。
33. 根据权利要求32所述的组合物，其中，所述贴壁依赖性细胞选自由成骨细胞、成纤 维细胞、表皮细胞、脂肪细胞、神经细胞、内皮细胞、上皮细胞、角化细胞、肝细胞、肌细胞、来 自关节韧带的细胞以及来自髓核的细胞组成的组中。
34. 根据权利要求22至33中任一项所述的组合物，其中，所述可降解的水凝胶选自由 由天然聚合物制成的水凝胶、合成水凝胶以及它们的组合组成的组中。
35. 根据权利要求34所述的组合物，其中，所述天然聚合物选自由多糖、粘多糖和蛋白 质组成的组中。
36. 根据权利要求35所述的组合物，其中，所述多糖选自由藻酸盐、琼脂糖、壳聚糖、葡 聚糖、淀粉和结冷胶组成的组中。
37. 根据权利要求22至36中任一项所述的组合物，其中，所述可降解的水凝胶包含藻 酸盐。
38. 根据权利要求34所述的组合物，其中，所述合成水凝胶选自由亲水性单体制成的 水凝胶、由亲水性聚合物制成的水凝胶、由亲水性共聚物制成的水凝胶和它们的组合组成 的组中。
39. 根据权利要求38所述的组合物，其中，所述亲水性单体选自由2-羟乙基甲基丙烯 酸酯、2-羟乙基丙烯酸酯、2-羟乙基甲基丙烯酰胺、2-羟乙基丙烯酰胺、N-2-羟乙基乙烯基 氨基甲酸酯、2-羟乙基乙烯基碳酸脂、2-羟丙基甲基丙烯酸酯、羟己基甲基丙烯酸酯、羟辛 基甲基丙烯酸酯、丙烯酸、甲基丙烯酸、衣康酸、富马酸、巴豆酸、马来酸、单甲基马来酸酯、 单乙基马来酸酯、单甲基富马酸酯、单乙基富马酸酯、（甲基）丙烯酰胺、巴豆酰胺、肉桂酰 胺、马来酰二胺、富马酰二胺、甲硫醇、乙硫醇、1-丙硫醇、丁硫醇、叔丁硫醇、戊硫醇、对苯乙 烯磺酸、乙烯基磺酸、p-a -甲基苯乙烯磺酸、异戊二烯亚砜及其盐组成的组中。
40. 根据权利要求38所述的组合物、其中、所述亲水性聚合物选自由乙交酯、丙交酯 的聚合物和低聚物；聚乳酸；a-醇酸的聚酯，其中所述醇酸包括乳酸和乙醇酸，例如聚 (a -羟基）酸，包括聚乙醇酸、聚-DL-乳酸、聚-L-乳酸；以及DL-丙交醋和乙交醋的三元 共聚物；e -己内酯和与聚酯共聚的e -己内酯；聚内酯和聚己内醋，包括聚（e -己内酯）、 聚（e -戊内酯）和聚（y-丁内酯）；聚酐；聚原酸酯；其他醇酸；聚二氧环己酮；胶原蛋 白-羟乙基甲基丙烯酸酯（HEMA);聚（羟乙基甲基丙烯酸酯）（PHEMA)以及无毒或在体内 作为代谢物存在的其他可生物降解的聚合物组成的组中。
41. 根据权利要求22至40中任一项所述的组合物，其中，所述水凝胶微粒包含在体温 下降解的可降解材料。
42. 根据权利要求22至41中任一项所述的组合物，其中，所述水凝胶微粒包含表面交 联的明胶。
43. 根据权利要求22至42中任一项所述的组合物，其中，所述水凝胶微粒包含用交联 剂交联的明胶。
44. 根据权利要43所述的组合物，其中，所述交联剂选自由京尼平、甲醛、戊二醛、1-乙 基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳二亚胺盐酸化物（EDC)、N-羟基琥珀酰亚胺（NHS)、N-羟基 硫代琥珀酰亚胺（Sulfo-NHS)和它们的混合物组成的组中。
45. 根据权利要求22至44中任一项所述的组合物，其中，所述水凝胶微粒包含在 0. 25wt %的京尼平溶液中交联的明胶。
46. 根据权利要求22至45中任一项所述的组合物，其中，所述水凝胶微粒的最大尺寸 在约50 y m至约200 y m之间。
47. 根据权利要求22至46中任一项所述的组合物，其中，所述组合物为可注射组合物。
48. 根据权利要求22至47中任一项所述的组合物，其中，所述水凝胶微粒具有提供额 外反应性基团的表面，所述额外反应性基团允许结合其它分子。
49. 根据权利要求22至48中任一项所述的组合物，其中，所述可降解的水凝胶和/或 所述水凝胶微粒进一步包含至少一种类型的生物活性分子。
50. 根据权利要求22至49中任一项所述的组合物，其中，所述生物活性分子选自由生 长因子、细胞因子、抗生素、抗炎剂、止痛剂和细胞粘附分子组成的组中。
51. 制造组织工程支架的方法，所述方法包括： a) 提供包含可降解的水凝胶和至少一种水凝胶微粒的混合物的组合物，所述水凝胶微 粒包含附着在其上和/或封装在其中的一种或多种活细胞； b) 在允许所述一种或多种活细胞增殖和所述至少一种水凝胶微粒在所述可降解的水 凝胶中降解的条件下培养所述组合物，以允许所述一种或多种活细胞增殖和所述至少一种 水凝胶微粒降解；以及 c) 降解经培养的所述混合物的所述可降解的水凝胶以获得支架。
52. 根据权利要求51所述的方法，其中，所述至少一种水凝胶微粒和所述可降解的水 凝胶包含影响所述水凝胶微粒的降解的致孔剂。
53. 根据权利要求52所述的方法，其中，所述致孔剂包含酶或主要由酶组成。
54. 根据权利要求52或53所述的方法，其中，致孔剂选自由胶原酶、蛋白酶、糖苷酶、链 霉蛋白酶、酪蛋白酶、软骨素酶、皮肤素酶、弹性蛋白酶、明胶酶、肝素酶、透明质酸酶、角蛋 白酶、脂肪酶、金属蛋白酶、葡激酶、链激酶、糜蛋白酶、肽链内切酶V8、胰蛋白酶、嗜热菌蛋 白酶、胃蛋白酶、血纤维蛋白溶酶和它们的组合组成的组中。
55. 根据权利要求52至54中任一项所述的方法，其中，所述致孔剂包含胶原酶或主要 由胶原酶组成。
56. 根据权利要求52至55中任一项所述的方法，其中，所述可降解的水凝胶包含一种 或多种活细胞。
57. 根据权利要求56所述的方法，其中，所述可降解的水凝胶和/或所述水凝胶微粒中 包含的所述一种或多种活细胞为非贴壁依赖性细胞，选自由软骨细胞、胚胎干细胞、成体干 细胞、内胚层谱系细胞和用于再生医学的癌细胞组成的组中。
【专利摘要】制造包含提供附着在其上和/或封装在其中的一种或多种活细胞的水凝胶微粒的方法。该方法包括将水凝胶形成剂溶解于水性介质中以形成溶液；将一种或多种活细胞悬浮于溶液中以形成细胞悬浮液；将该细胞悬浮液分散于有机油中，以形成微乳液；以及使该微乳液经历允许水凝胶形成剂形成包含附着在其上和/或封装在其中的一种或多种活细胞的水凝胶微粒的条件。还提供了包含可降解的水凝胶和具有一种或多种活细胞的至少一种水凝胶微粒的混合物的组合物以及制造组织工程支架的方法。
【IPC分类】A61L27-52
【公开号】CN104582747
【申请号】CN201380042205
【发明人】王东安, 刘婷婷, 梁文嫣
【申请人】南洋理工大学
【公开日】2015年4月29日
【申请日】2013年7月26日
【公告号】EP2882465A1, US20150217024, WO2014025312A1