有软骨的血液动力学性质的 组织或基质的细胞。干细胞是指具有自我复制能力并且还具有分化为至少两种细胞的能力 的细胞，其可被分为全能干细胞（totipotent stem cell)、多能干细胞（pluripotent stem cell)和专能干细胞（multipotent stem cell)。
[0060] 在各种实施方式中，一种或多种活细胞包含软骨细胞。例如，一种或多种活细胞可 W主要由软骨细胞组成或由软骨细胞组成。一种或多种活细胞可W是至少基本上均匀地分 散于细胞悬浮液中。
[0061] 一种或多种活细胞的浓度可W根据存在的水凝胶形成剂的量而变化。在各种实 施方式中，细胞悬浮液中活细胞的量可在约1 X 103细胞ml 至约1 X 10 W细胞ml 4的水凝 胶形成剂的范围内，例如约1 X 103细胞ml 至约1 X 10 7细胞ml 4、约1 X 105细胞ml 至约 lX107细胞ml-l、约lX105细胞ml-哇约lX10l°细胞ml-l、约lX107细胞ml-哇约lX10… 细胞ml-i、约lXl〇5细胞ml-i、约lXl〇6细胞ml-i、约lXl〇7细胞ml-i或约lX10 8细胞ml-l。 在一些实施方式中，细胞悬浮液中的活细胞的量为约1 X 1〇7细胞ml的水凝胶形成剂。
[0062] 然后将包含一种或多种活细胞和水凝胶形成剂的细胞悬浮液分散于有机油中W 形成微乳剂。通过将细胞悬浮液分散于有机油中，细胞悬浮液被乳化W形成具有水相和油 相的微乳液，其中水相包含一种或多种活细胞和水凝胶形成剂，油相包含有机油。
[0063] 有机油可W是矿物油或者植物或动物来源的油。如本文中使用的，术语"矿物油" 是指是指来自含碳来源（例如石油、页岩和煤或其等价物）的姪油。在优选的实施方式中， 有机油为植物或动物来源的油。可W使用的有机油的实例包括，但不限于，豆油、玉米油、葵 花巧油、油菜巧油、棉巧油、花生油、橄揽油、芝麻巧油、大米胚芽油、鱼油、嫁油、栋桐油、挪 子油、大麻巧油、菜巧油、麦胚油、红花油、亚麻巧油、桐油、藍麻油和它们的混合物。在各种 实施方式中，有机油包含豆油。在一些实施方式中，有机油主要由豆油组成或由豆油组成。
[0064] 本文中使用的术语"微乳液"和"乳液"可互换使用，并且是指两种或更多种不混 溶液体的分散体系。因此，将一种液体乳化到另一种液体中会导致形成两个不同的相，其中 一种液体的小液滴可W被分散（例如分离并分布在整个空间内）在另一种液体中。该液体 的小液滴被称为分散相，而小液滴分散于其中的另一种液体被称为连续相。
[00化]大多数微乳液由作为不混溶相的水和油或脂肪组成。根据相的组成和比率，存在 两种分布方式。在水相的情况下，例如水"W"为连续相而油"0"为分散相，结果是"0/W乳 液"或水包油乳液，其基本特性由水相决定。如果油"0"为连续相而水"W"为分散化则结 果为"W/0乳液"或油包水乳液，其中基本特性由油决定。
[0066] 如上文中所述，在根据第一个方面的方法中，细胞悬浮液（其为水系的）被分散于 有机油（其为油系的）中，W形成油包水（W/0)乳液。在一些实施方式中，有机油可W含有 表面活性剂W使分散于其中的细胞悬浮液稳定，W形成油包水乳液。例如，表面活性剂可W 包含疏水性表面活性剂或主要由疏水性表面活性剂组成。该样的表面活性剂的实例包括， 但不限于，脱水山梨醇醋、脱水山梨醇单醋、脱水山梨醇=油酸醋、脱水山梨醇=硬脂酸醋、 脱水山梨糖醇酢倍半油酸醋、脱水山梨醇单月桂酸醋、脱水山梨醇单栋桐酸醋、脱水山梨醇 单硬脂酸醋、脱水山梨醇单油酸醋、单油酸甘油醋、单硬脂酸甘油醋、PE0/PP0共聚物、它们 的衍生物和它们的混合物。
[0067] 在各种实施方式中，将细胞悬浮液分散到有机油中是在持续揽拌或者能够乳化两 个不混溶相的任何形式的分散方法的条件下进行的。有利的是，利用持续揽拌允许通过改 变揽拌速度而简单地控制所形成的微粒尺寸。通常，较低的揽拌速度导致较大的乳化液滴 尺寸，并且会转化为增加所形成的微粒尺寸。另一方面，较高的揽拌速度会导致较小的微 粒。因此，揽拌速度可被用来影响所形成微粒的尺寸。
[0068] 本文中所使用的揽拌速度可W在约15化pm至约2000巧m的范围内，例如约15化pm 至约 1500;rpm，约 150巧m 至约 1000;rpm，约 300巧m 至约 2000;rpm，约 300巧m 至约 1500;rpm， 约300巧m至约1000;rpm，约300巧m至约700巧m、约300巧m、约400巧m、约500巧m、约600巧m 或约7(K)巧m。在各种实施方式中，W约5(K)巧m的速度进行持续揽拌。根据用于形成细胞悬 浮液的材料的类型，例如，过低的揽拌速度会导致用于形成微乳液液滴的剪切力不足。
[0069] 持续揽拌可W进行形成微乳液所必需的任意适合的时间。例如，持续揽拌可W进 行几分钟，例如约1分钟至约60分钟，约1分钟至约30分钟，约1分钟至约15分钟，约1 分钟至约10分钟，约1分钟至约5分钟，约2分钟至约30分钟，约2分钟至约15分钟，约 2分钟至约10分钟，约2分钟至约5分钟，约5分钟至约30分钟，约5分钟至约15分钟， 约5分钟至约10分钟或约5分钟、约4分钟、约3分钟、约2分钟或约1分钟范围内的时间 段。在各种实施方式中，将细胞悬浮液分散到有机油中是在持续揽拌约2分钟的条件下进 行的。
[0070] 第一个方面的方法包括使微乳液经历使水凝胶形成剂形成为包含附着在其上和/ 或封装在其中的一种或多种活细胞的水凝胶微粒的条件。有利地，该允许一种或多种活细 胞在单一步骤过程中与水凝胶微粒结合，其转化为处理简便性和效率。一种或多种活细胞 可被负载且位于微粒中，并且另外地或可替代地，可在微粒的表面处存在。在各种实施方式 中，一种或多种活细胞至少基本均匀地分散于水凝胶微粒中。在各种实施方式中，包含在微 乳液中的水凝胶形成剂被固化W形成水凝胶微粒。
[0071] 在各种实施方式中，使微乳液经历允许水凝胶形成剂形成包含附着于其上和/或 封装于其中的一种或多种活细胞的水凝胶微粒的条件包含将微乳液W及包含于其中的水 凝胶形成剂，在约〇°C至约10°C范围内的温度下冷却，例如约0°C至约8°C，0°C至约6°C， 0 °C 至约 4°C，0 °C 至约 2 °C，2 °C 至约 10 °C，2 °C 至约 8 °C，2 °C 至约 6 °C，5 °C 至约 10 °C，7 °C 至约 io°c或约o°c、约rc、约2°c、约：rc、约4°c或约5°c。在各种实施方式中，通过冷却该微乳 液，包含在微乳液中的水凝胶形成剂被凝胶化或固化，从而封装一种或多种活细胞。
[0072] 在形成水凝胶微粒时或水凝胶微粒形成后，可从乳液提取有机油。例如，有机油和 水凝胶微粒可经历分离过程（例如离屯、）W将有机油与水凝胶微粒分离，并且其可W存在 为两个相，W使得易于从微乳液提取有机油。第一方面的方法可W在有机油的提取之后进 一步包括至少一个离屯、步骤和至少一个清洗步骤。该至少一个离屯、步骤和至少一个清洗步 骤可作为纯化步骤对所形成的用于储存和/或应用的微粒进行清洁。
[007引如本文中使用的，术语"微粒"是指具有测量为微米Um)级别尺寸的微观的颗 粒。微粒的尺寸可由其最大尺寸来表征。如在本文中适用的，术语"最大尺寸（maximal dimension)"是指穿过微粒中屯、并在边缘处终止的直线部分的最大长度。在微球的情况下， 微球的最大尺寸对应于其直径。术语"平均最大尺寸"是指微粒的均值或平均最大尺寸，并 且可通过用每个微粒的最大尺寸的和除W微粒的总数来计算。因此，最大尺寸的平均值可 用于任意形状微粒的计算，例如具有常规形状的微粒，例如球形、半球形、立方形、棱柱形或 菱形或不规则形状的微粒。
[0074] 所形成的水凝胶微粒的最大尺寸可W在约50 ym至约200 ym的范围内，例如约 50 ym至约150 ym，约50 ym至约100 ym或约50 ym至约75 ym。在各种实施方式中，所形 成的水凝胶微粒基本上是单分散性的。
[0075] 在第二个方面，本发明设及包含根据第一个方面的可降解的水凝胶与包含附着在 其上和/或封装在其中的一种或多种活细胞的至少一种水凝胶微粒的混合物的组合物。在 另一个方面，本发明还设及包含可降解的水凝胶与包含附着在其上和/或封装在其中的一 种或多种活细胞的至少一种水凝胶微粒的混合物的组合物，其中可降解的水凝胶和水凝胶 微粒中的至少一种包含影响水凝胶微粒降解的致孔剂。
[0076] 如本文中使用的，术语"可降解的水凝胶"是指具有在特定条件（例如温度、磨擦、 pH、离子强度、电压、电流效应、福照和生物学手段）下可降解为较小分子的结构的水凝胶。
[0077] 热降解是指利用热施加于材料，W使其分解为较小的分子。磨擦降解或物理降解 是指在材料上施加力或压力W将材料破坏为较小的部分。化学降解是指使用通过溶液的pH 或离子强度的影响或者通过与材料的化学反应将材料降解为较小的分子的化学试剂（例 如水凝胶）。例如，化学降解的形式可W是水解降解，其中明胶在水的存在下经历水解降解， 并且能够产生被称为的胶原蛋白水解物（CH)的产物，其可含有平均分子量为3至6kDa的 肤。
[007引电降解是指使用电流和/或电压通过材料W使得材料被分解。在福照降解中，使 用例如丫波和紫外波的电磁波W降解材料。可降解的水凝胶也可W被生物降解，即，其是 可生物降解的。术语"可生物降解的"是指当暴露于自然中通常存在的环境条件时能够被 微生物分解或在相对短的时间内（在2至15个月内）自发分解的物质。例如，明胶能够被 体内存在的酶降解。
[0079] 在一些实施方式中，可降解的水凝胶的降解可在几秒至几天或几个月的时间段内 发生。水凝胶降解所需的时间段可取决于几个参数，例如，水凝胶的构成，例如所使用的水 凝胶前体或水凝胶形成剂的类型W及水凝胶的水含量、交联度、温度、pH、存在的水性介质 的量W及凝胶化过程中的压力。在生理条件下，该意味着在动物体内，通常在约2个月后发 生。如上文所述，可通过使水凝胶经历交联而延长该时间段。
[0080] 可降解的水凝胶可形成或作为至少一种水凝胶微粒的基质或框架。在各种实施方 式中，可降解的水凝胶中存在多个水凝胶微粒，并且该水凝胶微粒可W至少基本均匀地分 散于该可降解的水凝胶基质中。
[0081] 可降解的水凝胶可由与水凝胶微粒相同或不同的材料形成。在各种实施方式中， 可降解的水凝胶由与水凝胶微粒中包含的材料不同的材料形成。该可降解的水凝胶可选自 由天然聚合物制成的水凝胶、由合成聚合物制成的水凝胶W及它们的组合组成的组中。例 如，形成可降解的水凝胶的聚合物的（一种或多种）类型的具体选择可取决于预期应用。
[0082] "天然聚合物"是指可在自然中发现的聚合物材料。在各种实施方式中，水凝胶由 选自由多糖、粘多糖、蛋白质和它们的混合物组成的组中的天然聚合物形成。该些水凝胶也 可被称为"天然水凝胶"。
[0083] 多糖是可被水解为两个或更个单糖分子的碳水化合物。它们可W含有重复的碳水 化合物（即糖）单元的骨架。多糖的实例包括，但不限于，藻酸盐、琼脂糖、壳聚糖、葡聚糖、 淀粉和结冷胶。粘多糖为含有氨基糖作为组分的多糖。粘多糖的实例包括，但不限于，透明 质酸、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸角质素、硫酸葡聚糖、硫酸肝素、肝素、葡萄糖醒酸、艾 杜糖醒酸、半乳糖、半乳糖胺和葡糖胺。
[0084] 形成多肤W及蛋白质的构建块的肤通常是指通过肤键连接的氨基酸短链。通常， 肤包含约2至100个，更典型地为约4至50个，且最通常为约6至20个氨基酸的氨基酸 链。多肤通常是指单个直链或支链的氨基酸序列，其通常比肤要长。其通常包含长度为至 少约20至1000个氨基酸，更典型地至少约100至600个氨基酸，并且经常为至少约200至 约500个氨基酸。包括一种特定氨基酸的共聚物，例如，聚赖氨酸。蛋白质包括单个多肤W 及多条多肤链的复合物，其可W相同或不同。
[0085] 蛋白质可具有生物学功能并且可被分为五种主要类型，即，结构性蛋白质例如胶 原蛋白、催化性蛋白质例如酶、转运性蛋白质例如血红蛋白、调