血清组b脑膜炎球菌和d/t/p的联合疫苗的制作方法
【专利说明】血清组B脑膜炎球菌和DA/P的联合疫苗
[0001] 本申请要求2012年9月6日提交的美国临时申请61/697,756的权益，其全部内 容通过引用纳入本文以用于所有目的。
技术领域
[0002] 本发明属于联合疫苗，即含有来自多于一种病原体的混合免疫原的疫苗的领域， 从而给予该疫苗可使对象同时获得针对多于一种病原体的免疫力。
【背景技术】
[0003] 单一剂量中含有来自多于一种病原性生物体的抗原的疫苗被称为"多价"疫苗或 "联合"疫苗。已有多种联合疫苗被许可用于人类，包括用于保护抵抗白喉、破伤风和百日咳 的三价疫苗或保护抵抗麻疫、腿腺炎和风疫的三价疫苗。这些疫苗为患者提供的益处在于 减少了注射次数，这可导致顺应性提高的临床益处（例如参见参考文献1的第29章），对小 儿患者尤其如此。
[0004] 提供新型联合疫苗的一个难处是，混合组分之间存在疫苗-疫苗负面相互作用的 可能，这可归因于物理因素或化学因素。例如，参考文献2讨论了抗原联用时免疫原性的可 能变化，而参考文献3报告了联合疫苗的开发涉及的问题远多于现有抗原的简单混合。类 似地,参考文献4综述了多种临床相关相互作用（也参见参考文献5),而参考文献6综述了 制造联合疫苗时所面临的技术挑战。
[0005] 本发明的目的在于，提供新型且改进的联合疫苗，而具体是能够保护抵抗血清组B 脑膜炎球菌和其它病原体的那些。
【发明内容】
[0006] 发明人已显示，血清组B脑膜炎球菌抗原能够成功地与白喉、破伤风和百日咳类 毒素（"DTP")联合，以提供用于保护抵抗多种病原体的有效联合疫苗。这些联合疫苗在佐 以一定范围的不同佐剂时均有效，并且在采用小儿型和加强型DTP比例时均有效。所述佐 剂能够改善所述组合物引发的免疫应答；或者，通过包括佐剂，所述组合物能够具有相对较 低量的抗原但仍具有与未加佐剂的联合疫苗相当的免疫原性。
[0007] 因此，一般而言，本发明提供一种免疫原性组合物，其包含（a)血清组B脑膜炎球 菌免疫原，和（b)白喉类毒素、破伤风类毒素和/或百日咳类毒素中的至少一种。所述组合 物通常还包含佐剂，例如错盐或水包油乳剂。优选组分（b)包含白喉类毒素、破伤风类毒素 和百日咳类毒素的全部三种。在一些实施方式中，组分（b)包含的白喉类毒素多于破伤风 类毒素（以Lf单位测量），但在其它实施方式中，其包含的破伤风类毒素多于白喉类毒素。
[0008] 第一方面中，本发明提供一种免疫原性组合物，所述免疫原性组合物包含：(a)血 清组B脑膜炎球菌免疫原；(b)白喉类毒素、破伤风类毒素和百日咳类毒素；和（c)佐剂。所 述佐剂可包含一种或多种铝盐佐剂、TLR激动剂或水包油乳剂。
[0009] 第二方面中，本发明提供一种免疫原性组合物，所述免疫原性组合物包含：(a)血 清组B脑膜炎球菌免疫原；和（b)白喉类毒素、破伤风类毒素和百日咳类毒素，其中存在的 白喉类毒素相对过量于破伤风类毒素（以Lf单位计）。该组合物还可包含佐剂，并且其可 包含一种或多种铝盐佐剂、TLR激动剂或水包油乳剂。
[0010] 第三方面中，本发明提供一种免疫原性组合物，所述免疫原性组合物包含：(a)血 清组B脑膜炎球菌免疫原；和（b)白喉类毒素、破伤风类毒素和百日咳类毒素，其中存在的 破伤风类毒素相对过量于白喉类毒素（以Lf单位计）。该组合物还可包含佐剂，并且其可 包含一种或多种铝盐佐剂、TLR激动剂或水包油乳剂。
[0011] 本发明的组合物可包含除白喉类毒素、破伤风类毒素和百日咳类毒素以外的抗 原，例如，其可包含Hib荚膜糖（理想上是偶联的）、HBsAg、IPV、脑膜炎球菌荚膜糖（理想 上是偶联的）等。
[0012] 脑膜炎球菌血清组B免疫原
[0013] 本发明的免疫原性组合物包含血清组B脑膜炎球菌免疫原。当给予人（或给予合 适的动物模型）时，所述免疫原可引发杀菌性免疫应答。这些免疫原可以是蛋白质、脂糖或 囊泡。
[0014] 本领域已知的不同血清组B脑膜炎球菌蛋白质免疫原包括但不限于：NHBA、fHbp 和NadA，如BEXSER0?产品中所见[7, 8]。可包含在本发明组合物中的其它蛋白质免疫原 有：HmbR、NspA、NhhA、App、0mp85、TbpA、TbpB、Cu, Zn-过氧化歧化酶和 ZnuD。这些免疫原 的其它细节描述于下文。
[0015] 疫苗可包含这些不同免疫原中的一种或多种，例如，其可包含各NHBA、fHbp和 NadA。其还可包含单一免疫原的多个变体形式，例如，其可包含脑膜炎球菌fHbp的多于一 种变体（即，序列不同的两种fHbp蛋白[191,9])。
[0016] 所述血清组B脑膜炎球菌蛋白质免疫原可以融合蛋白的形式存在。例如，所述 BEXSER0?产品包含两种融合蛋白：SEQ ID N0:4是NMB2091和fHbp的融合形式；而SEQ ID N0:5是NHBA和NMB1030的融合形式。一种有用的融合蛋白是SEQ ID勵：19，其包含匪82091 和两拷贝fHbp。
[0017] 血清组B免疫原的两种有用的组合包括：NHBA，例如SEQ ID NO: 5 ;fHbp例如SEQ IDN0:4或SEQIDN0:19;和NadA，例如SEQIDN0 :6。其它有用的组合包括如下蛋白质： 其与SEQ ID NO: 5、4、19和6各有至多5个氨基酸的差异，但保留引发识别SEQ ID NO: 5、4、 19和6的抗体的能力。
[0018] 优选包含至少一种fHbp免疫原的组合物，例如，包含两种不同fHbp序列的那些。 合适的fHbp组合物在下文详细讨论。
[0019] 因此，本发明的组合物可有利地包含（a)在参考文献8中公开为'5CVMB'的三种 血清组B脑膜炎球菌蛋白质免疫原的混合物，或（b)在参考文献10中公开为'rLP2086'的 血清组B脑膜炎球菌蛋白质免疫原的混合物。
[0020] 所述血清组B脑膜炎球菌免疫原通常是纯化的可溶性重组蛋白。然而，在一些实 施方式中，其可存在于脑膜炎球菌囊泡中。因此，所述组合物可包含脑膜炎球菌囊泡，即，通 过脑膜炎球菌外膜的破坏或出泡以由此形成的保留有源自所述外膜的抗原的囊泡而获得 的任何蛋白脂质体囊泡。因此该术语包括，例如OMV(有时称为"小泡")、微囊泡（MV)和"原 初OMV"（ "N0MV)。"本领域已知多种此类囊泡（例如，参见参考文献11-25)，并且其中任何 囊泡均可包含在本发明的组合物中。关于这些囊泡，在下文中有更详细的说明。然而，在一 些实施方式中，所述组合物不含囊泡。
[0021] 本发明的组合物可优选地在给予后引发血清杀菌性试验。这些应答可以在小鼠中 方便地测得，并且是疫苗效力的标准指标。血清杀菌活性（SBA)衡量由补体介导的细菌杀 伤力，并且可以采用人或幼兔补体进行试验。例如，组合物可在超过90%的受者中诱导至少 4倍的SBA上升。
[0022] 优选地，本发明的组合物可在人类中引发保护性抵抗血清组B脑膜炎球菌的免疫 应答。例如，所述疫苗可引发至少保护性抵抗原型血清组B菌株（例如，MC58)的免疫应答， MC58可通过广泛途径获得（例如，ATCC BAA-335)并且是参考文献26中测序的菌株。还可 采用其它菌株，但抵抗MC58的应答容易测试。
[0023] 白喉类毒素
[0024] 白喉是由白喉棒状杆菌（Corynebacterium diphtheriae)，一种或多革兰氏阳性 无孢子需氧菌产生的。该生物体表达原噬菌体编码的ADP-核糖基化外毒素（"白喉毒素")， (例如用甲醛）处理后得到无毒但保留抗原性的类毒素，能够在注射后刺激特异性抗毒素 抗体的产生。参考文献1的第13章更详细地揭示了白喉类毒素。优选的白喉类毒素是通过 甲醒处理制备的那些。采用可补充牛提取物的生长培养基（如Fenton培养基，或Linggoud 和Fenton培养基）培养白喉棒杆菌（C. diphtheriae),接着进行甲醒处理、超滤和沉淀，可 获得白喉类毒素。该类毒素物质随后可通过包括无菌过滤和/或透析的方法来处理。
[0025] 组合物可包含足够的白喉类毒素以引发至少0. 01IU/ml的循环白喉抗毒素水平。 白喉类毒素的量一般以"Lf"单位（"絮凝单位〃或〃边界絮凝剂量〃或〃絮凝限值"）度 量，其定义为：当与一个国际单位的抗毒素混合时，产生最优絮凝混合物的毒素/类毒素的 量[27, 28]。例如，NIBSC 提供了'普通白喉类毒素 （Diphtheria Toxoid, Plain)' [29]，其 含有300Lf/安瓿，也提供了'用于絮凝试验的白喉类毒素的第一国际参比试剂' [30]，其含 有900Lf/安瓿。组合物中白喉类毒素的浓度可以采用絮凝试验，通过按所述参比试剂校准 的参比物质相比较来容易地确定。
[0026] 组合物中的白喉类毒素的免疫效力一般以国际单位（IU)表示。所述效力可通过 将组合物在实验室动物（通常是豚鼠）中提供的保护与已经校准到IU的参比疫苗做比较 来评估。NIBSC提供'白喉类毒素吸附第三国际标准1999(Diphtheria Toxoid Adsorbed Third International Standard 1999)，[31，32]，其包含 160IU/安瓶，并且适用于校准此 类试验。
[0027] IU与Lf系统间的转换取决于具体的类毒素制剂。
[0028] 本发明的组合物通常包含1?40Lf白喉类毒素/单位剂量。在白喉类毒素相对过 量于破伤风类毒素（以Lf单位计）存在的小儿型组合物中，所述组合物将一般包含10? 35Lf的白喉类毒素/单位剂量，例如，15?30Lf，例如15、25或30Lf。在破伤风类毒素相 对过量于白喉类毒素过量（以Lf单位计）存在的加强型组合物中，所述组合物将一般包含 1?4Lf的白喉类毒素/单位剂量，例如，1. 5?3Lf，例如2或2. 5Lf。若组合物包含偶联 至白喉类毒素的糖抗原，则前述量排除那些偶联物中的载体蛋白的量。
[0029] 按IU衡量，小儿型组合物将一般包含>25IU的白喉类毒素/单位剂量，而加强型 组合物将一般包含1?3IU/单位剂量。
[0030] 如果组合物包含铝盐佐剂，则所述组合物中的白喉类毒素优选被吸附至（更优选 被完全吸附至）所述佐剂，并且优选被吸附在氢氧化铝佐剂上。
[0031] 破伤风类毒素
[0032] 破伤风是由破伤风梭菌（Clostridium tetani)，一种革兰氏阳性有芽孢杆菌产生 的。该生物体表达内肽酶（"破伤风毒素"），经处理后得到无毒但保留抗原性的类毒素，能 够在注射后刺激特异性抗毒素抗体的产生。参考文献1的第27章更详细地揭示了破伤风 类毒素。优选的破伤风类毒素是通过甲醛处理制得的那些。采用生长培养基（如衍生自牛 酪蛋白的Latham培养基）培养破伤风梭菌（C. tetani)，然后进行甲醒处理、超滤和沉淀，能 够获得破伤风类毒素。此物质随后可通过包括无菌过滤和/或透析的方法处理。
[0033] 组合物可包含足够的破伤风类毒素以引发至少0,01lU/ml的循环破伤风抗毒素 水平。破伤风类毒素的量一般以〃Lf〃单位（参见上文）表示，其定义为当与一个国际单位 的抗毒