改性马立克氏病病毒及从其制备的疫苗的制作方法
【专利说明】改性马立克氏病病毒及从其制备的疫苗
[0001] 通过引用并入
[0002] 本申请要求2012年3月22日提交的美国临时专利申请No. 61/614, 142的优先权， 其通过引用整体并入本文。 发明领域
[0003] 本发明总地来说涉及病毒疫苗和使用所述病毒疫苗的方法。更具体地，本发明涉 及用于保护鸡免受马立克氏病病毒感染并且具有比现有疫苗有所提高的安全性和效力的 新型疫苗。
[0004] 背景
[0005] 马立克氏病（Marek' s disease, MD)是一种鸡的高度流行和重要的淋巴组织增生 病，其在商业化鸡中受由减毒的或天然无毒力的MD相关疱瘆病毒组成的活病毒疫苗控制。 虽然免疫接种程序被认为总体上是有效的，但养禽业因 MD而继续经受损失。鉴于MD病毒 随时间过去变得更具毒力（例如通过回复至毒力更强的形式）的倾向与养禽业面临的经济 压力相联系，仍然存在开发更安全和更有效的产品的强烈动机，所述产品在面临毒力非常 强的野生株的早期攻击时将提供更好的保护作用而不引起有害副作用（例如胸腺营养不 良）。
[0006] 在鸡中发现有3种不同血清型的MD病毒：（1)血清型1，其负责疾病的致瘤形 式，包括高和低毒力MD病毒以及它们的减毒变体；（2)血清型2,是一种非致瘤MD病毒； 和（3)血清型3,为火鸡疱瘆病毒（HVT)。早期MD疫苗由最初从火鸡分离的血清型3病 毒组成，如 Witter 等人[Am. J. vet. Res. 31:525-538(1970)]和 Okazaki 等人[美国专利 No. 3, 642, 574]中报导的。其致瘤性的缺乏、自限性感染、体内和体外良好的复制、可作为 无细胞制剂和细胞结合制剂获得以及高保护效力已使HVT确立为世界范围内WID疫苗的标 准。通常使用的HVT的株系为FC126。
[0007] 从天然无毒力的 SB-I 株[Schat 等人，J. Natl. Cancer inst. 60: 1075_1082 (I978) 和美国专利No. 4, 160, 0241，血清型2MD病毒的分离株]生产的疫苗自1984年来已在美 国得到批准。SB-I株对抗高毒力MDV株的保护作用很弱。其通常与HVT组合用作双价 疫苗，因为这两种病毒一起产生大于任一种病毒单独产生的保护作用[Schat等人，Avian Pathol. 11:593-606(1982) ;Witter, Avian Pathol. 11:49-62(1982)，将所述文献的内容通 过引用并入本文]。该现象被称为〃保护协同作用"。SB-1+HVT双价疫苗目前占据了超过 50%的MD疫苗美国市场，并且被认为是可获得的各种最有效MD产品之一。然而，尽管使用 了这种双价疫苗，仍然存在偶发损失。
[0008] 从CVI988株C克隆（CVI988/C)产生的另一种MD疫苗在美国已被批准商业使用。 该疫苗来源于通过在组织培养中连续传代而减毒的具有轻度毒力的血清型IMD病毒，并且 已由De Boer等人[Avian Dis. 30:276-283(1986)]报导。CVI988/C的另外的传代衍生物已 由 De Boer 等人[Advances in Marek's Disease Research, PP. 405-43 (1988)]描述，表征 为CVI988/C/R6。最近，发现已在其它国家商业使用许多年的称为CV1988/Rispens的原始 低代株（low-passage strain)高度有效地抗几个毒力非常强的MD病毒株的攻击，Witter 等人[4th Inti. Symp. Marek，s Disease, ρρ· 315-319 (1992)] 〇
[0009] 来源于Mdll (-种毒力非常强的血清型IMD野生分离株）的实验性疫苗已由 Witter (同上）报导。Mdll通过在细胞培养中连续传代75次来进行减毒，所得的疫苗称为 Mdll/75C。已显示该疫苗可提供良好的抗Md5和测试的大部分其它高毒力MD病毒的攻击 的保护作用；但其对抗JM/102W株（被HVT和SB-I疫苗有效地抵抗的原型MD病毒）的攻 击不太有效。此外，其效力在具有HVT抗体的鸡中始终更低。
[0010] 美国专利No. 4,895,717，Witter公开了 Mdn/75C的回复突变衍生物，其被称为 Mdll/75C/R2。已显示Mdll/75C/R2优于几种其它单价疫苗，并且等同于双价（HVT+SB-1) 疫苗[Witter, Avian Dis. 31:752-765(1987)]。然而，血清型1病毒的固有致病性和减毒 株回复至更大致病性的潜力[Witter等人，Avian Pathol. 13:75-92(1984)]是批准这样的 产品所要考虑的因素。Witter等人[Avian Dis. ,35:877-891(1991)]发现称为Mdll/75C/ R2/23 (或R2/23)的从Mdn/75C/R2株进一步传代衍生的克隆具有亲代株的高保护性性质而 无其残存致病性。
[0011] Witter还在美国专利No. 4, 895,718(将其内容通过引用并入本文）中描述了从 301B/1 ( -种非致病性血清型2野生分离株）衍生的另一种MD疫苗，该301B/1株具有比 SB-I更优越的复制能力，以及更大的抗病毒攻击保护作用。
[0012] 还描述了称为RMl的重组马立克氏病病毒，其具有稳定地整合入其基因组的重复 短（RS)区域内的网状内皮组织增殖病毒的长末端重复。该病毒株是在USDA-ARS-ADOL从致 病性血清型1马立克氏病病毒株JM产生的[Witter等人，1997, Avian Dis. ,41:407-421， 和 Jones 等人，1996, J. Virology, 70 (4) : 2460-2467]。然而，虽然 RMl 株已显示提供了与 CVI988的保护水平相似或更高的保护水平，但其还与残存致病性相关，在处理的禽类中引 起胸腺营养不良。
[0013] 因此，尽管现有 HVT、SB-l、CVI988、CVI988/C、Mdll/75C、Mdll/75C/R2*301B/l* 都引发抗特定MD病毒的免疫反应，但这些疫苗均未在所有鸡中提供最佳地抗所有MD攻击 病毒的保护作用。此外，这些疫苗已显示抗一些最近分离的MD病毒极强毒株的效力降低。 为了避免将来任何大规模的MD爆发，需要开发抗MD病毒的高强毒株的效力更为提高的更 安全的疫苗。
[0014] 发明概述
[0015] 本发明部分地基于最初在申请号USSN 10/623, 891 (属于Reddy等人，公布为 US2005/0019348A1)中公开的包含马立克氏病病毒（MDV)的疫苗的生产和应用，将所述申 请的内容以及所述申请的完整审查历史通过引用整体并入本文。具体地，本发明起源于 令人惊讶的意外发现：CVRM2 "病毒"（利用外来DNA构建体转化的MDV株"CVI988" ；例如 在Reddy等人的表1中公开的）实际上不是克隆上明确的单个重组减毒马立克氏病病毒 (MDV)。相反地，申请者确认了 CVRM2是重组MDV和亲代MDV的异质群体，当他们分离CVRM2 的纯克隆系（在下文中称为"RN1250"）并随后给禽类施用时，他们获得了远超本领域技术 人员在阅读Reddy等人时所预期的结果的安全性和效力结果。
[0016] 根据该发现，本发明的一个目的是提供一种在禽类（包括鸡）中抗MD的新型高度 保护性疫苗。本发明的另一目的是提供与目前商业使用的那些疫苗相比能提供抗马立克氏 病病毒超强毒株更大保护作用的疫苗。
[0017] 本发明的又一个目的是提高鸡（特别地肉鸡和产蛋鸡）的活力和生产力，以及减 少由马立克氏病引起的养禽业的经济损失。
[0018] 这些和其它实施方案已被公开，或根据下列详述变得明显，包括在下列详述中。
[0019] 附图概述
[0020] 图1显示MDV基因组的示意性组织，所述基因组包含侧翼连接有反向重复（IRS) 的独特长序列区域（UL)、末端重复长序列区域（TRL)、内部重复长序列区域（IRL)和独特的 短区域（US)，并且侧翼连接两个反向重复序列，内部重复短序列（IRS)和末端重复短序列 (TRS)。还显示了重叠粘粒克隆的图示，其产生来从MDV的高强毒株拯救传染性病毒；
[0021] 图2描述了用于产生CVRM疫苗的MO-Pac粘粒的产生；
[0022] 图3举例说明了重组MDV的基于PCR的诊断；显示了 PCR引物、预期的产物尺寸和 琼脂糖凝胶图像，该图像显示CVRM2不是克隆性的，但实际上是重组MDV与亲代MDV的二元 群体。泳道：1)梯度条带；2)阴性；3)Rispens ;4)GA 22 ;5)Rismavac ;6)RBlB ;7)RN1250 ; 8)阳性（原始混合群体）；
[0023] 图 4 提供了 RN1250 MSV、RN1250 x+