比目鱼的病毒性出血性败血症预防用疫苗的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及比目鱼的病毒性出血性败血症预防用疫苗。
【背景技术】
[0002] 病毒性出血性败血症（VHS，Viral Hemorrhagic Septicemia)被称为艾特韦 (Egtved)病，该病为发生在全世界的淡水和海水鱼类中并引发大量毙死的疾病。就韩国而 言，2001年第一次在比目鱼中报告之后，不断地在庆北及济州地区中确认，从水温变低的晚 秋到春季，在小的鱼苗及大的鱼体中引起毙死，导致养殖业受损严重。病毒性出血性败血症 因病毒性出血性败血症病毒（VHSV)的感染而产生，受感染的比目鱼等鱼类出现身体颜色 变黑、腹部膨胀和疝气等症状，最快1周，最晚1个月后呈现出毙死的倾向，因此需要注意管 理养殖渔场。
[0003] 病毒性出血性败血症的原因病毒为单链的RNA病毒，是一种具有弹状病毒科 (Rhabdoviridae)和粒外弹状病毒（Novirhabdovirus)属的外膜的病毒。大小为50? 70X180?240nm，病毒粒子的模型呈典型的弹状病毒的形态，即子弹形，一侧呈圆状，另 一侧呈扁平状。在学界中，基于从淡水分离的病毒性出血性败血症病毒的糖蛋白基因碱 基序列区分为基因型，这些基因型根据地理分离来源，普遍区分为美式（American type; Genogroup I )、不列颠群岛式（British Isles type ;Genogroup II )、欧式（European type ;Genogroup III)即3种基因型。根据中和抗体试验分为3个血清型，这些血清型之间 发生交叉反应。已知从韩国分离的基因型与属于基因型（Genogroup) I的北美地区和从日 本分尚的病毒相似。并且，从比目鱼分尚的病毒性出血性败血症病毒与从淡水鱼分1?的其 病毒具有基因学上的区分，但没有血清学上的区分。
[0004] 病毒性出血性败血症为水产动物疾病管理法第2条的水产动物传染病，是在15°C 温度以下的低水温期引起比目鱼的毙死的病毒性疾病，毙死率高，传染性强，因而在宗庙中 检测到的情况下，以禁止排放、限制向其他区域移动的方式进行管理。
[0005] 病毒性出血性败血症一旦发病，就会迅速传染，因而预防疾病非常重要，但仅通过 改善饲养环境及饲养管理来抑制疾病的发生是受限的。因此，作为更根本的预防对策，急需 开发一种疫苗。
[0006] 至今，所开发的用于预防由细菌引起的疾病的疫苗很多，但除了挪威法玛克 (Pharmaq)公司的针对传染性胰腺坏死病毒（IPNV)的疫苗和诺华动物保健（Norvartis animal health)公司的用于预防传染性造血器官坏死病的DNA疫苗，S卩Apex-IHN及日本的 虹彩病毒的灭活疫苗等之外，几乎没有为了预防鱼类病毒引起的疾病而常用化的疫苗，在 韩国国内，成为许可项目的病毒疫苗也是从日本进口的虹彩病毒灭活疫苗的1种。并且，病 毒性出血性败血症的疫苗执行针对出血性败血症病毒的结构和抗原蛋白的研宄，并基于这 些基础研宄执行针对灭活疫苗、重组蛋白疫苗、减毒疫苗、DNA疫苗等的研宄，但尚未开发确 保稳定性及功效的疫苗。这意味着难以探索用于制备鱼类病毒疫苗的适当的候选疫苗，难 以有效地制备疫苗，并难以确保稳定性等。
[0007] 对此，本发明人通过分析在韩国国内所产生的病毒性出血性败血症，来选择候选 疫苗，并利用上述候选疫苗来开发用于预防比目鱼的病毒性出血性败血症的最佳的疫苗， 由此完成了本发明。
【发明内容】
[0008] 技术问题
[0009] 因此，本发明的目的在于，提供比目鱼的病毒性出血性败血症预防用灭活疫苗。
[0010] 本发明的另一目的在于，提供利用上述比目鱼的病毒性出血性败血症的预防方 法。
[0011] 解决问题的手段
[0012] 为了达成上述目的，本发明提供包含被灭活的病毒性出血性败血症病毒 FP-VHS2010-01抗原（KCTC 12153BP)的比目鱼的病毒性出血性败血症预防用灭活疫苗。
[0013] 本发明提供包括将上述比目鱼的病毒性出血性败血症预防用灭活疫苗向比目鱼 给药的步骤的比目鱼的病毒性出血性败血症的预防方法。
[0014] 发明的效果
[0015] 本发明的比目鱼的病毒性出血性败血症预防用灭活疫苗能够有效地预防在比目 鱼中所产生的病毒性出血性败血症，因而能够有用地使用于比目鱼的养殖业等。
【附图说明】
[0016] 在图1至图4中，将从实施例1分离的病毒性出血性败血症病毒FP-VHS2010-01 的糖蛋白碱基序列与已知的作为病毒性出血性败血症病毒的NCBI AY167587 (NBCI)、 FP-VHS2005-01(2005 年济州分离）、FP-VHS2010-02(2010 年浦项分离）及 FP-VHS2011-01 (2011年济州分离）的糖蛋白碱基序列进行了比较。
[0017] 图5为表不以多种浓度将从实施例1分尚的病毒性出血性败血症病毒 FP-VHS2010-01接种于多种大小的比目鱼之后的累积毙死率（％ )的曲线图。
[0018] 图6为确认将从实施例1分离的病毒性出血性败血症病毒FP-VHS2010-01接种于 比目鱼之后的肾脏组织内免疫基因的表达率的结果。图6a表示条件树（condition tree)， 图6b表示散点图（scatter plot)，图6c表示扫描图像。
[0019] 图7为利用多克隆抗体以图7a的十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS-PAGE)法及图7b的免疫印迹法分析从实施例1分离的病毒性出血性败血症病毒 FP-VHS2010-01的结构蛋白的照片。在各图中，泳道M加载了标记，泳道1加载了病毒性出 血性败血症病毒FP-VHS2010-01。
[0020] 图8为将从实施例1分离的病毒性出血性败血症病毒FP-VHS2010-01接种于EPC 细胞株之后，在多种温度下培养的细胞的照片。图8a表示正常细胞，图8b至图8d表示在 病毒接种之后经3天的时间分别在15°C、20°C及25°C温度下培养的细胞。
[0021] 图9表示将从实施例1分离的病毒性出血性败血症病毒FP-VHS2010-01接种于 EPC细胞株之后，分别在图9a的培养烧瓶（125cm2)及图9b的滚瓶（850cm2)中培养的结 果。
[0022] 图10为将分别利用图IOa的福尔马林及图IOb的热接种被灭活的病毒性出血性 败血症疫苗的EPC细胞株培养2天之后的照片。
[0023] 图11为表示疫苗处理方法及当处理疫苗时基于比目鱼的饲养水温的免疫相关基 因的表达率变化的照片。A表示高温实验组，B表示低温实验组，C表示对照组，在A及B中， 泳道1及泳道2为疫苗浸渍组，泳道3及泳道4为疫苗注射组，在C中，泳道1及泳道2为 阴性对照组，泳道3及泳道4为PBS用药组。
[0024] 图12为表示疫苗处理方法及当处理疫苗时基于比目鱼的饲养水温的攻击实验之 后的比目鱼的生存率的曲线图。
[0025] 图13为表示在本发明的处理疫苗之后实施攻击实验的情况下的平均累积毙死 率（图13a)、溶菌酶活性（图13b)及针对病毒性出血性败血症病毒的酶联免疫吸附试验 (ELISA)结果的曲线图。
[0026] 图14为在使用本发明的疫苗之后，以H&E染色观察比目鱼的各脏器组织的照片。
【具体实施方式】
[0027] 本发明提供包含被灭活的病毒性出血性败血症病毒FP-VHS2010-01 (KCTC 12153BP)抗原的比目鱼的病毒性出血性败血症预防用灭活疫苗。
[0028] 用于本发明的疫苗的病毒性出血性败血症病毒FP-VHS2010-01作为被分离为 在巨济的养殖场中引起比目鱼的大量毙死的原因病毒的菌株，确认了是不同于已知的 病毒性出血性败血症病毒（在基因库（GenBank)登录的AY 167587 ;2005年从济州分 离的FP-VHS2005-01 ;2010年从浦项分离的FP-VHS2010-02及2011年从济州分离的 FP-VHS2011-01)的菌株（参照图1至图4)。
[0029] 以 2X 107TCID50/ 条、2X 106TCID50/ 条及 2X 105TCID50/ 条的浓度对比目鱼注 射作为使用于上述疫苗的菌株的病毒性出血性败血症病毒FP-VHS2010-01的情况下，在注 射的第6天呈现出50%以上的毙死率，在注射的第2周呈现出90-100%的毙死率，比目鱼 的大小越小且病毒的浓度越高，这种毙死率就越增加。并且，上述病毒性出血性败血症病毒 FP-VHS2010-01在比目鱼受感染时，与未受感染的比目鱼相比，使免疫基因增加3至13倍以 上。这表不上述病毒性出血性败血症病毒FP-VHS2010-01为病原性非常尚的病毒。
[0030] 本发明的疫苗可借助该领域中所公知的制备方法来制成。上述方法包括疫苗菌株 的培养、病毒菌株的分尚、病毒的灭活、浓缩及稀释等过程。
[0031] 在本发明的一具体例中，上述病毒性出血性败血症病毒疫苗能够以将18? 22°C温度、优选为20°C温度作为最佳的条件中的一个，来培养病毒性出血性败血症病毒 FP-VHS2010-01的方式获得。上述温度条件诱导病毒性出血性败血症病毒FP-VHS2010-01 的最大增殖，从而使本发明的疫苗内的抗原增加变得有利。可使用EPC细胞株作为用于 培养上述病毒的细胞株，但并不局限于此，可使用该领域中所公知的细胞株，例如BF-2、 RTG-2、FHM、CHSE-214 等。
[0032] 在其他具体例中