5%C02 9 5%饱和湿度的细胞培养箱培养。当观察到有贴壁细胞出现，当细胞生长铺满培养皿底30%左右时更换培养液，去除不贴壁的非人胚胎骨髓来源间充质干细胞和血细胞。以后每日观察，隔日换液，当细胞生长铺满培养皿底80%时传代，传代时按1: 3的比例进行传代接种培养，传代培养基采用含10%胎牛血清的DMHM培养基。
[0020]步骤2:生物膜的制备和预处理
A.配制静电纺丝溶液:称取0.50gPCL颗粒，溶解于4ml氯仿中；另称取0.025g胶原，溶解于Iml六氟异丙醇中(HFIP)中，各自用磁力搅拌子搅拌过夜(大于12h)。将溶解好的两种溶液进行混合，用磁力搅拌子搅拌12h以上，得到静电纺丝溶液；
B.静电纺丝过程:将静电纺丝溶液装入注射器中，注射器配置直径0.6mm的钝性转头，在电压lOkv，收集距离即喷头与接受盘之间的距离为15cm，液流速度为0.75ml/h的条件下电纺；
C.后期处理:电纺完成后，将静电纺丝膜在通风橱中2~3小时，待残余有机溶剂完全挥发，得到单纯高分子聚乙内酯多元醇(PCL)膜-胶原复合膜即生物膜；
D.生物膜的预处理:在细胞接种前，将单纯高分子聚乙内酯多元醇(PCL)-胶原复合膜置入适宜大小的培养皿中，用3M的NaOH于37°C浸泡2h，PBS缓冲液浸泡10次，每次15分钟。
[0021]步骤3:间充质干细胞生物膜的构建
将预处理后的生物膜置于培养皿底部，然后接种来源于骨髓的P3-P6代间充质干细胞单细胞悬液，所用的培养基为90%DMEM培养基和10%胎牛血清替代品(含青霉素100U/mL，含链霉素100 μ g/mL, pH7.4)，连续培养48小时，即构建完成干细胞生物膜。
[0022]步骤4:间充质干细胞生物膜的诱导
将构建间充质干细胞生物膜的培养皿更换培养液，仍用90%DMEM培养基和10%胎牛血清替代品(含青霉素100U/mL，含链霉素100 μ g/mL，pH7.4)，不同的是添加TNF α ( α肿瘤坏死因子)诱导培养4-5小时，其中TNFa的诱导浓度为50_100ng/ml，然后将制备的生物膜用PBS清洗两遍并置于37°C、5%C02细胞培养箱30分钟后备用。
[0023]步骤5:抗黑色素瘤的干细胞贴剂的形成
将诱导后的间充质干细胞生物膜从培养箱中取出，添加1000U白细胞介素I1、100mg维生素C和20 μ I富血小板血浆，然后将生物膜置于由防粘层和粘贴层组成的医用级粘胶层上，即制备完成抗黑色素瘤的干细胞贴剂。
[0024]关于人胚胎骨髓来源间充质干细胞的伦理说明:
人胚胎骨髓来源的间充质干细胞的胚胎是自然流产的胚胎组织，属于医学上废弃的胚胎组织，是自然或自愿流产，且流产胎儿母亲完全知情同意，签署知情同意书。根据科学技术部、卫生部2003年12月颁发的《人胚胎干细胞研宄伦理指导原则》中明确指出:用于研宄的人胚胎干细胞可以通过自然或自愿选择流产的胎儿细胞获得；另外，根据卫生部办公厅、国家食品药品监督管理局于2013年3月发布的《干细胞临床试验研宄管理办法(试行)》征求意见稿中指出，来源于胎儿组织的细胞已经作为临床实验研宄的种子细胞，因此本方法采用胎儿股骨组织的骨髓源间充质干细胞符合当前规定。
[0025]具体实施例2:来源于骨髓的间充质干细胞的流式鉴定
分离获得的人胚胎骨髓来源间充质干细胞经流式细胞仪检测后显示:CD166阳性细胞为95%以上，⑶34阳性细胞小于3 %(⑶166是BMSC细胞膜的特征性表面标志，BMSC细胞膜不表达⑶34)，台盼蓝检测细胞活性在95%以上。
[0026]实施例3动物试验
1.黑色素瘤小鼠动物模型的制备
①制备浓度为IX17个/ml B16黑色素瘤细胞悬液；②用备皮刀将6_8周龄的C57BL/6J小鼠背部毛发去除，去毛面积约为4cm2 ;③向40只小鼠的背部皮下注射B16黑色素瘤细胞，每只0.2ml ;隔天观察肿瘤生长情况，测量硬结大小，观测小鼠生存期并记录相关数据。
[0027]2.黑色素瘤小鼠的治疗
一周后将荷瘤小鼠随机分成2组，每组20只，实验组瘤体处敷制备成功的干细胞贴剂，对照组未敷贴剂作为空白对照，每四天更换一次贴剂，连续治疗4次。更换贴剂时用游标卡尺测量瘤体长与宽，计算瘤体体积[V=abb/2 (a为肿瘤最大径，b为肿瘤最小径)]及抑瘤率[(对照组肿瘤体积-实验组肿瘤体积)/对照组肿瘤体积X 100%]，观察并分析荷瘤鼠的存活率。
[0028]3.黑色素瘤小鼠动物模型实验结果
①测定小鼠的肿瘤体积大小，在未经治疗前两组肿瘤体积无明显差异。治疗后，对照组和实验组肿瘤体积大小明显差异，对照组小鼠肿瘤生长迅速，而对照组肿瘤生长受到明显抑制(如图2所示)，抑瘤率可达90% (如图3所示)；
②对照组与实验组小鼠生存时间比较有显著差异(P〈0.01)，对照组荷瘤小鼠生存时间明显延长(如图4所示)。
[0029]以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1.一种抗黑色素瘤的干细胞贴剂，其特征在于，由下述主要原料和基质部分制备而成，主要原料包括IX 16个来源于骨髓的间充质干细胞，100U白细胞介素I1、100mg维生素C和20 μ I富血小板血浆，基质部分包括生物膜和医用级粘贴层。
2.根据权利要求1所述的一种抗黑色素瘤的干细胞贴剂，其特征在于，所述的来源于骨髓的间充质干细胞优选来自于胚胎骨髓组织的间充质干细胞。
3.根据权利要求1所述的一种抗黑色素瘤的干细胞贴剂，其特征在于，至少包括I X 15个来源于骨髓的间充质干细胞，包括I X 10 6个来源于骨髓的间充质干细胞。
4.权利要求1所述的一种抗黑色素瘤的干细胞贴剂的制备方法，其特征在于，由下述步骤组成:来源于骨髓的间充质干细胞的制备，生物膜的制备和预处理，间充质干细胞生物膜的构建，间充质干细胞生物膜的诱导和抗黑色素瘤的干细胞贴剂形成；其中， 所述的来源于骨髓的间充质干细胞的制备步骤具体是:分离提取来源于骨髓的间充质干细胞，混匀成单细胞悬液备用； 所述的生物膜的制备和预处理步骤具体是:制备高分子聚乙内酯多元醇-胶原复合生物膜作为基础基质，在细胞接种前进行生物膜的预处理:将生物膜置入适宜大小的培养皿中，用3Μ的NaOH于37°C浸泡2h，PBS缓冲液浸泡10次，每次15分钟； 所述的间充质干细胞生物膜的构建步骤具体是:将上述步骤制备的生物膜置于培养皿底部，然后接种来源于骨髓的间充质干细胞单细胞悬液，所用的培养基为90%DMEM培养基，和10%胎牛血清替代品，连续培养48小时； 所述的抗黑色素瘤的干细胞贴剂的诱导步骤具体是:向上述步骤培养皿更换培养液，仍用90%DMEM培养基，和10%胎牛血清替代品，并添加TNF α ( α肿瘤坏死因子)诱导培养4-5小时，其中TNF α的诱导浓度为50_100ng/ml，然后将制备的生物膜用PBS清洗两遍并置于37°C、5%C02细胞培养箱30分钟后备用； 所述的抗黑色素瘤的干细胞贴剂的形成步骤具体是:将上述步骤制备的生物膜从培养箱中取出，添加1000U白细胞介素I1、10mg维生素C和20 μ I富血小板血浆，然后将生物膜置于由防粘层和粘贴层组成的医用级粘胶层上，即制备完成抗黑色素瘤的干细胞贴剂。
【专利摘要】本发明提供了一种抗黑色素瘤的干细胞贴剂，本发明的干细胞贴剂具有间充质干细胞分子标志和生物学特性、免疫原性低，不发生免疫排斥，并添加针对黑色素瘤的有效因子等，可以有效治疗和修复黑色素瘤。本发明还提供上述干细胞贴剂的制备方法，由下述步骤组成，包括：来源于骨髓的间充质干细胞的制备，生物膜的制备和预处理，间充质干细胞生物膜的构建、间充质干细胞生物膜的诱导和抗黑色素瘤的干细胞贴剂形成。该方法采用来源广泛的干细胞产品，制备过程简单、可靠、重现性好。
【IPC分类】A61P35-00, A61K9-70, A61K35-28, A61K47-42, A61K31-375, A61K38-20, A61K47-34, A61K35-16
【公开号】CN104623638
【申请号】CN201510025603
【发明人】周萱
【申请人】奥思达干细胞有限公司
【公开日】2015年5月20日
【申请日】2015年1月20日