纳米级直径的连续纤维（例 如，Zhang等，Int J Nanomed，2 (4) :623-638 (2007))。通常，电纺丝涉及使用经过喷丝头 (spinneret)进入的溶液以及向尖端施加高电压。带电溶液中静电排斥的积累导致其喷射 细纤维流。所安装的具有相反或接地电荷的集电板或棒拉出连续纤维，其形成高度多孔的 网络。这种技术的优点包括其简单性和易于变化。在实验室水平，通常的电纺丝设置仅需 要高压电源（高达30kV)、注射器、平顶针头和导电集电器。通过修改变量（例如到集电器 的距离、施加电压的大小或溶液流速），可改变整个支架结构。
[0063] 如本领域技术人员所理解的，可将多种另外的组分添加至支架。例如，可使用一种 或更多种化妆品成分。在一个特定的方面中，将芦荟与纳米纤维支架组合以机械地保持细 胞并促进其产物释放到微环境中。在再一个方面中，使用芦荟和PCL来产生纳米纤维支架。 在某些方面中，纳米纤维支架中PCL与芦荟的比值为约10 : 5。支架中的芦荟和PCL均是 可生物降解的。
[0064] 还如本领域技术人员所理解的，组合物可包含有助于伤口愈合的另一些组分。例 如，组合物还可包含一种或更多种抗生素、银、纤维蛋白或其组合。
[0065] 伤口可与组合物接触的时间量将根据许多因素（包括伤口的类型、个体的病症 等）来变化，所述组合物包含（i)沃顿胶质干细胞（WJSC)，（ii)已经用WJSC调节的细胞培 养基，（iii)WJSC的裂解物，（iv)已经用暴露于凋亡的皮肤细胞和瘢痕瘤细胞的WJSC调节 的细胞培养基，或（V)其组合。因此，时间量可为数分钟、数小时、数天、数周、数月和数年不 等。在某些方面中，将伤口与组合物接触约24小时至约21天。
[0066] 在另一些方面中，本发明涉及包含本文所述之医用敷料的药物组合物。可用生理 上可接受的载体或赋形剂来配制用于本文所述方法的药物组合物以制备药物组合物。载体 和组合物可以是无菌的。制剂应适于施用模式。
[0067] 引入这些组合物的方法包括但不限于皮内、肌内、腹膜内、眼内、静脉内、皮下、表 面、经口和鼻内施用。施用可发生在局部，例如在伤口的部位（例如，边缘）和/或全身性。 本发明的药物组合物还可作为与其他化合物的组合疗法的一部分施用。
[0068] 如本文所示，可将组合物与方法用于治疗伤口或瘢痕（例如，瘢痕瘤）。如本文所 使用的，"治疗"是指愈合伤口或瘢痕。在一个方面中，完全愈合伤口或瘢痕。在另一些方面 中，部分愈合伤口或瘢痕，例如，伤口愈合但是具有减少的或最小的瘢痕形成；瘢痕形成的 量是减少或降低的。
[0069] 此外，在本文所述的方法中，将伤口与有效量（治疗有效量）的组合物接触（即， 足以治疗伤口或瘢痕，例如通过缓解与伤口或瘢痕相关的症状和/或还减少伤口或瘢痕之 严重程度的量）。可通过标准的临床技术来确定在特定个体的伤口或瘢痕的量，所述量在治 疗中是治疗有效的并且取决于伤口或瘢痕的症状和严重程度。用于制剂中的精确剂量还取 决于施用途径以及伤口或瘢痕的严重程度，并且应该根据医师的判断和每个个体的情况来 决定。有效剂量可从来源于体外或动物模型测试系统的剂量-反应曲线来推断。
[0070] 例如，如本文所述，对于1^几(：，使用约0.5\106个细胞/10(^1至10\10 6个细 胞 /100 μ 1 ;对于 hWJSC-CM 和 hWJSC-PCM，使用约 50% w/v 至 100% w/v 浓度的约 50 μ 1 至 200 μ 1并且调节约24小时至72小时；对于hWJSC-CL，使用约50 μ 1至200 μ 1的约10 μ g/ ml至50 μ g/ml的蛋白质。
[0071] 本文所述的组合物和方法可用于多种个体。在一个特定的方面中，所述个体是哺 乳动物。如本文所使用的，术语"哺乳动物"和"哺乳动物的"是指任何脊椎动物，包括单孔类 动物、有袋类动物和胎盘动物，其哺乳其幼崽并且生育活的幼崽（真兽类或胎盘哺乳动物） 或者产卵（后兽类或非胎盘哺乳动物）。哺乳动物的实例包括灵长类（例如，人、猴子、黑 猩猩）、啮齿类（例如，大鼠、小鼠、豚鼠）、犬科、猫科和反刍动物（例如，牛、猪、马）。在一 个特定的方面中，所述个体是人。在另一些方面中，所述个体是犬科（例如，狗）、猫科（例 如，猫）、牛科（例如，牛）、马科（例如，马）等。
[0072] 因此，本文所述组合物和方法可用于经过包括外科手术切口之任何形式的外科手 术的住院个体（例如，促进伤口愈合并抑制任何瘢痕瘤形成）或用于经历创伤的个体。此 外，本文所述的组合物和方法可用于患有缓慢愈合的糖尿病和非糖尿病伤口的个体；在事 故/外科手术之后易于形成瘢痕瘤的患者；在床上不动的患有褥疮的个体；烧伤受害者；以 及创伤受害者。所述组合物和方法还可用于经过美容手术以防止瘢痕瘤形成的个体以及用 在动物护理（兽医）行业中。
[0073] 本发明还涉及有效量的组合物用于在有此需要的个体中治疗（治疗）伤口的用 途，所述组合物包含（i)沃顿胶质干细胞（WJSC)，（ii)已经用WJSC调节的细胞培养基， (iii)WJSC的裂解物，（iv)已经用暴露于凋亡的皮肤细胞和瘢痕瘤细胞的WJSC调节的细 胞培养基，或（V)其组合。在另一个方面中，本发明还涉及有效量的组合物用于制造用来在 有此需要的个体中治疗（治疗）伤口之药物的用途，所述组合物包含（i)沃顿胶质干细胞 (WJSC)，（ii)已经用WJSC调节的细胞培养基，（iii)WJSC的裂解物，（iv)已经用暴露于凋 亡的皮肤细胞和瘢痕瘤细胞的WJSC调节的细胞培养基，或（V)其组合。
[0074] 在另一个方面中，本发明涉及有效量的组合物用于制造用来在有此需要的个体中 治疗（治疗）伤口以抑制瘢痕形成之药物的用途，所述组合物包含（i)沃顿胶质干细胞 (WJSC)，（ii)已经用WJSC调节的细胞培养基，（iii)WJSC的裂解物，（iv)已经用暴露于凋 亡的皮肤细胞和瘢痕瘤细胞的WJSC调节的细胞培养基，或（V)其组合。
[0075] 示例 [0076] 实施例1
[0077] 方法/材料
[0078] 实验设计
[0079] 在动物模型中体外和体内进行二维（没有芦荟纳米筛的人沃顿胶质干细胞 (hWJSC)、hWJSC调节的培养基（hWJSC-CM)、预处理的hWJSC调节的培养基（hWJSC-PCM)或 MJSC细胞裂解物（hWJSC-CL))和三维（具有芦荟纳米筛的hWJSC、hWJSC-CM、hWJSC-PCM 或hWJSC-CL)研宄。对于体外研宄，在生长于培养皿的皮肤成纤维细胞单层上制造线性划 痕以模拟伤口（常规的划痕测定（(Linag 等，Nature Protocols，2 :329-333 (2007)))。在 暴露于具有或不具有芦荟纳米筛的hWJSC、hWJSC-CM、hWJSC-PCM或hWJSC-CL的划痕单层 上进行形态学改变、增殖速率、胶原蛋白、弹性蛋白和基因组测定。对于动物研宄，在免疫缺 陷（Animal Resource Centre，Australia)和糖尿病小鼠 （Jackson Laboratories，USA)的 背部皮肤上制造直的和圆形伤口。将动物中的伤口分别暴露于（通过在伤口的若干部位注 射）具有 / 不具有芦荟纳米筛的 hWJSC/hWJSC-CM/hWJSC-PCM/hWJSC-CL (hWJSC :约 0. 5 X IO6 个细胞 /100 μ 1 至 IOX IO6个细胞 /100 μ I ;hWJSC-CM 和 hWJSC-PCM :50 μ 1 至 200 μ 1 约 50% w/v至100% w/v浓度并且调节约24小时至72小时；hWJSC-CL :50 μ 1至200 μ 1的约 10 μ g/ml至50 μ g/ml的蛋白质）。与伤口组织活检的组织病理学和免疫组织化学检查一 起测量愈合率（伤口闭合的时间）以得到更详细的伤口愈合和闭合信息。有两组对照用于 所有体外和体内动物实验。（对照1 :未治疗的伤口；对照2:用与实验臂相同的方式但是用 皮肤成纤维细胞和皮肤成纤维细胞调节的培养基（CM)、预处理的调节的培养基（PCM)或细 胞裂解物（CL)治疗的伤口）。
[0080] 从脐带分离纯的人沃顿胶质及其储存
[0081] 用无菌剪刀将数段人脐带（1.5cm)剪开并且在37°C下，在5% 0)2空气气氛中将内 表面暴露于酶的混合物（1型胶原酶、4型胶原酶、透明质酸酶）45分钟。然后在Dulbecco 改良Eagle培养基（DMEM)高葡萄糖培养基中洗涤带段（cord pieces)以除去所有酶痕量， 接着置于含有5ml新鲜DMEM高葡萄糖培养基的60mm无菌培养皿中。使用一对钟表制造 镊子（watchmaker forcep)的钝背表面来从各带段的内表面中将胶状沃顿胶质刮到培养 基中。在移出沃顿胶质之后，丢弃剩余的带段并且将培养基中的胶状沃顿胶质转移到15ml Falcon管中。然后经过连接到IOml注射器的21号针头将胶状沃顿胶质注射以打碎胶质并 释放hWJSC。将细胞悬液在300 X g下离心5分钟并收集上清液（不含细胞的沃顿胶质）。 可新鲜使用该胶质来浸渗纳米芦荟筛或在_80°C冷冻以进一步使用。例如，可将沃顿胶质的 胶状块冷冻，并且在解冻之后，可从沃顿胶质分离hWJSC并在培养物中使其生长。
[0082] hWJSC、hWJSC调节的培养基（CM)、hWJSC裂解物和预处理的hWJSC调节的培养基 (PCM)的制备
[0083] 根据 Fong 等，Reprod Biomed，I5 :7〇8_718 (2〇〇7) ;Fong 等，Reprod Biomed，2I : 391-401(2010)(这两者均通过引用并入本文）的方法来从废弃的脐带获取和繁殖人沃顿 胶质干细胞（hWJSC)。
[0084] 首先通过在包含补充有20%胎牛血清（FBS)、1 %非必需氨基酸、2mM L-谷 氨酰胺、0. ΙπιΜβ-巯基乙醇、1%胰岛素-转铁蛋白-硒（ITS)、抗生素/抗真菌混合 物（Invitrogen)和 16ng/ml 喊性成纤维细胞生长因子（FGF) (Millipore Bioscience Research Agents，Temecula，CA)的80% DMEM高葡萄糖之复合培养基中培养hWJSC来制 备hWJSC调节的培养基（CM)(提取物）。当hWJSC单层达到80%的汇合度时，用具有/不 具有knockout血清替代物培养基（KOSR)的包含补充有L-谷氨酰胺和抗生素/抗真菌溶 液之DMEM高葡萄糖的简单培养基来替换培养基。在约24小时、48小时或72小时之后，将 该简单培养基分离、过滤并称为hWJSC-CM。
[0085] 分别地，使用含有蛋白酶抑制剂混合物和二硫苏糖醇的哺乳动物细胞提取试剂盒 (BioVision，Mountain View，CA)从生长至80%汇合度的早期传代hWJSC(P3至P7)制备 hWJSC裂解物。简言之，将培养的细胞用不含钙和镁的磷酸缓冲盐水（即，PBS(-))洗涤一 次，用TrypLETMexpress来解离并在500gX下离心5分钟以获得细胞沉淀。将所述沉淀重 悬于100 μ 1的细胞裂解缓冲液中并上下吹打数次，然后在冰上孵育15分钟。随后将内容 物在12000gX下离心5分钟（Eppendorf，德国）并且分离澄清的上清液（细胞裂解物）， 在-80 °C下储存直到使用。
[0086] 在收集调节的培养基之前，通过将hWJSC暴露于特定的低氧和/或凋亡培养基环 境来制备预处理的调节的培养基。分别地，将具有/不具有knockout血清替代物培养基 (KOSR)的包含补充有L-谷氨酰胺和抗生素/抗真菌溶液之DMEM高葡萄糖的简单培养基暴 露于WJSC，在不同氧环境（例如，小于或等于约5% )中的濒死/活的凋亡原发性皮肤和瘢 痕瘤培养物，并且在约24小时至72小时之后从WJSC分离调节的培养基。目的是利用通过 皮肤和瘢痕瘤细胞释放的任何有用成分。该CM称为预处理的调节的培养基（PCM)。
[0087] 纳米芦荟筛的制备
[0088] 收集新鲜的芦荟叶，并用水充分洗涤并风干。将风干的芦荟植物粉碎（pulverize) 并用甲醇提取。使用旋转蒸发仪（rota vapour)来蒸发残留的甲醇，然后冷冻干燥终产物。 将聚己酸内酯（PCL)(分子量80, 000)和芦荟的粗提物通过持续搅拌24小时溶解于六氟丙 醇（hexaf Iuropropanolol)中。以1.0 mL/小时的流量和高电压将PCL/芦荟的混合聚合物 溶液加入连接到22G针头的3ml标准注射器中并且在玻璃盖玻片上电纺丝为纳米纤维、灭 菌并用作hWJSC生长的支架。将相同的支架分别在CM/PCM/裂解物中浸泡。
[0089] 芦荟/聚己酸内酯纳米纤维膜的制造
[0090] 聚己酸内酯（PCL，分子量80, 000)、氯仿和甲醇购自Sigma-Aldrich(USA)并且 芦荟经干燥的粉末是由安娜大学的纺织工程，金奈，印度（Textile engineering at Anna University，Chennai，India)赠送的。通过搅拌将 PCL/ 芦荟（约 15% w/v :约 10 : 5 的 比）溶解于氯仿/甲醇（3 : 1)中，均匀分布达24小时。在自动电纺丝机器（(Nan〇n-01A， MECC Co. Ltd. Japan)Nanon上进行电纺丝来制造纳米纤维膜。将作为背衬材料的覆盖有错 箔的旋转转鼓用于收集纳米纤维膜。将旋转速度固定在150rpm以使纳米纤维在旋转转鼓 上均匀喷涂。使用注射泵以3. Oml/小时的流量和使用高压电源施加的24kV电压将PCL/芦 荟样品加入连接到18G钝不锈钢针头的IOml标准注射器中。图2说明制成的膜和纳米纤维 的形态。在电纺丝之后，将制成的膜暴露于通风厨中的温和对流空气流中过夜以移除任何 残留溶剂。在室温下，在真空下将纳米纤维干燥过夜以移除存在于纳米纤维支架中的残留 溶剂。将膜切割成IOXlOcm片并储存在干燥器中。将不同大小（10mm至15mm)的盖玻片 铺在覆盖有铝箔的矩形不锈钢台上以收集纳米纤维从而研宄与培养的细胞的生物相容性 以及观察纳米纤维的结构和性质。用金（JE0L JFC-1600 Auto Fine Coater，Japan)来派 射涂覆电纺纳米纤维并在IOkV加速电压下通过场发射扫描电子显微术（SEM;FEI-〇UANTA 200F，Czech Republic)观察电纺纳米纤维以用于表征。
[0091] PCL/芦荟支架是随机筛设计并且具有高孔隙度（约85%至95% )以及约400nm 至425nm的纤维直径和约0. 5mm至Imm的厚度（图1)。纳米纤维支架的高孔隙度为细胞提 供了更多结构空间以更有效地促进支架与环境之间的营养物和代谢废物的交换。此外，所 述支架为细胞粘附提供了较大的表面并且还有助于保持机械稳定性以保护伤口床（wound bed)免受微生物侵入。这些特征是组织工程的纳米纤维支架的优选标准。所述支架为细 胞粘附提供表面并且还保持机械稳定性。当医师操作并将其植入伤口时，所述支架保留其 结构完整性和稳定性。所述支架（例如，芦荟纳米筛）在伤口中提供足够的生物力学支撑。 使用评估材料之机械性能的装置（Instron USA)来测试PCL/芦荟样品的吸收能力和生物 相容性。以兆帕测量的结果示出良好的吸收能力和生物相容性。用于制造支架的材料包括 合成聚合物和天然聚合物两者的整合，例如，为细胞（例如hWJSC、表皮和真皮成纤维细胞） 的生长提供有利的基材。
[0092] hWJSC/hWJSC-CM/hWJSC裂解物/hWJSC-PCM浸渗到纳米芦荟筛中
[0093] 将纳米芦荟筛用以下物质浸渗并制备成用于施加到伤口上的伤口敷料贴剂：（1) 单独的hWJSC⑵hWJSC-CM、hWJSC裂解物或hWJSC-PCM(3)具有或不具有纤维蛋白的hWJSC 或 hWJSC-CM 或 hWJSC 裂解物或 hWJSC-PCM。
[0094] 用绿色荧光蛋白（GFP)或红色荧光蛋白（RFP)来标记hWJSC
[0095] 用GFP或RFP来标记hWJSC以使用常规慢病毒转染方法在体外和动物研宄中进行 追踪。在荧光显微术下于hWJSC中观察到的绿色或红色有助于其鉴定。
[0096] 细胞增殖（(3-(4, 5-二甲基噻唑-2-基）-2, 5-二苯基四氮唑鑰溴化物（MTT)测 定）
[0097] 在0· 1 %明胶包被的24孔组织培养板（BD，Franklin Lakes，NJ)中以2X IO4个 细胞/孔的接种密度在基础培养基中培养皮肤成纤维细胞并且在用具有或不具有纳米凝 胶筛的hWJSC、hWJSC-CM、hWJSC-PCM或hWJSC-CL治疗72小时之后，评估其细胞增殖速率。 使用常规MTT (3-(4, 5-二甲基噻唑-2-基）-2, 5-二苯基四氮唑鑰溴化物）测定来评估细 胞增殖。
[0098] 划痕测定
[0099] 在 0· 1 % 明胶包被的 60mm培养皿（Nalgene NUNC International，Rochester，NY) 中以0.5X IO6的接种密度在基础（KOSR)培养基中培养皮肤成纤维细胞并培养24小时。将 皮肤成纤维细胞和hWJSC的各自0. 25X IO6个细胞一起接种到平皿中。在对照壁和实验臂 两者中用2ml带刻度血清移液管在中线上从培养皿顶部至底部垂直地制造均匀的划痕以 模拟伤口。用PBS轻轻地洗涤细胞碎片并且将对照细胞臂和混合细胞臂培养在基础（KOSR) 培养基中。在培养皿中在皮肤成纤维细胞的汇合单层上制造类似的划痕并且在37°C下在 5%0) 2气氛中将细胞分别暴露于具有或不具有纳米凝胶的111几(^1、111几(^^1、111几(：-(^ 72小时。使用Olympus倒置相衬显微镜每24小时有规律地监测细胞（hWJSC并且特别是皮 肤成纤维细胞以示出hWJSC-CM、hWJSC-PCM或hWJSC-CL的存在加速了皮肤成纤维细胞的增 殖以及由此划痕的闭合）到划痕（伤口）的迀移并进行成像，持续直到72小时或划痕（伤 口）完全闭合，二者之中更早的。将培养皿上的记号用作参照点以在成像期间获得相同的 场（field)〇
[0100] 胶原蛋白（Sircol)测定
[0101] 对于对照臂和治疗臂两者，均在〇. 1 %明胶包被的T-25组织培养瓶（BD，Franklin Lakes，NJ)中以0. 5X106个细胞至IXlO6个细胞的接种密度在基础培养基中培养皮肤成纤 维细胞。在基础（KOSR)培养基中培养对照臂，而在37°C下在5%