荧光显微法检测人体羊膜上 皮细胞。确定整体细胞的转染率大于95%。慢性病毒感染2天后，清洗3次人体羊膜细胞， 胰蛋白酶化（0. 25%胰蛋白酶），利用10% FBS中和，用磷酸盐缓冲盐水（PBS)之后再回溶 到培养基中。为了将所得人体羊膜上皮细胞移植到小鼠的卵巢内，腹膜注射戊巴比妥钠（45 毫克/千克）麻醉小鼠。在所得人类羊膜上皮细胞的密度达到85%后，感染带有绿色荧光 蛋白的慢性病毒，再继续感染和培育一周，之后将所得2Χ IO6人羊膜上皮细胞通过尾巴静 脉注射的方式移植进入接受化疗7天后的雌性小鼠受体中（治疗组小鼠 ，N = 20)，未治疗 的对照组小鼠则注射6微升细胞培养基（N = 15)，无移植相关死亡发生。
[0027] 免疫组化分析：将治疗组和对照组的小鼠卵巢置放在4%的多聚甲醛（4°C，过 夜），再使用分等级的乙醇系列脱水，用二甲苯玻璃化，内嵌于石蜡中。切片（6 ym)用中性 福尔马林缓冲液搁置5分钟，之后0. 3%过氧化氢浓度的甲醇中放置30分钟，内生的过氧 化酶反应停止。再在切片上加入小鼠抗人抗苗勒管激素（AMH，1 : 30, ABD Serotec公司， 英国牛津）以及抗人特异性核抗原（单克隆抗体，I : 300，EMD Millipore公司，达姆施塔 特，德国），或者腺垂体卵泡刺激素受体（FSHR，I : 100 ;Abcam公司，剑桥，英国）进行抗体 检测，过氧化物酶反应试剂盒（Vector Laboratories公司，伯林盖姆，CA，USA)应该按照制 造商说明使用。通过使用DAB基底（3, 39-二氨基联苯胺）生成过氧化物酶底物（Vector Laboratories公司）。载玻片上用苏木精QS (矢量实验室）重复染色，或者是增加载玻片 上用苏木精QS (矢量实验室）重复染色，或者是装载低粘度水性封固剂（Scytek实验室，洛 根，UT，USA)，或脱水并装载Vecta Mount永久封固剂（Vector Laboratories公司）。
[0028] 免疫荧光染色分析：将实施例1所得人体羊膜上皮细胞放置在4%的多聚甲醛中 15到20分钟，然后用磷酸盐缓冲液清洗2次（每次10分钟），在室温下，细胞在10分钟内都 渗透了 0. 1 %的聚乙二醇辛基苯基醚，然后用磷酸盐缓冲液清洗两次，细胞在封闭液中封闭 30分钟，加入抗-0CT4抗体（兔抗人1 : 200,圣克鲁斯生物工程，0GY，圣克鲁斯，CA，USA)， 抗-VASA抗体（山羊抗人1 : 200, Santa Cruz公司），抗-DAZL抗体（山羊抗人1 : 500， Santa Cruz公司），抗STELLA抗体（山羊抗人类1 : 200, Santa Cruz公司），抗NANOG抗 体（兔抗人I : 200，Millipore公司），抗-⑶117抗体（兔抗人I : 800，eBioscience公 司，CA，USA)对细胞进行培养，在室温下放置1小时。治疗组和对照组的小鼠卵巢固定于最 优切割温度（OCT)复合物（樱花，FINETEK，西雅图，美国）中，形成5μπι厚的新切片。用 磷酸盐缓冲液清洗载玻片两次，室温下用封闭溶液封闭30分钟，然后再使用多克隆兔抗绿 色荧光蛋白（稀释1 : 200, Chemicon公司，马萨诸塞州，美国）或者小鼠反核单克隆抗体 (1 : 50稀释；Millipore公司，马萨诸塞州，美国）在4°C下存放过夜培养细胞。用磷酸盐 缓冲液清洗细胞和切片3次，用探针使用荧光G(1 : 200,圣克鲁斯，CA，USA)标记免疫球蛋 白或者若丹明（TRITC)标记免疫球蛋白，通过莱卡DMI3000的显微镜（Heidelberg，德国） 来获取荧光图像。
[0029] 实验结果：在化疗结束后的7天到2个月，取小鼠卵巢进行免疫荧光组织学检测， 实验方法如上文所述，所得结果显示：在没有接受人羊膜上皮细胞移植的受体小鼠卵巢中， 化疗过程基本摧毁了所有未成熟的卵泡（包括最初的，基本的和第二阶段的卵泡），而未经 处理的对照组小鼠卵巢中仅含基质和间质细胞，闭锁卵泡增加，但没有绿色荧光蛋白表达。 接受人体羊膜上皮细胞移植14到21天的治疗组小鼠的卵巢产生基本卵泡，检测结果如图 1和图2所示，发现绿色荧光蛋白的表达和绿色荧光蛋白阳性的卵泡。其中图1为人体羊 膜上皮细胞移植14天的小鼠的卵巢产生的基本卵泡组织学检测结果。图2为人体羊膜上 皮细胞移植20天的小鼠的卵巢产生的基本卵泡组织学检测结果。通过对比发现，化疗小鼠 接受人体羊膜上皮细胞移植2个月后卵巢中会产生未成熟和成熟含卵母细胞的卵泡，其结 果如图3所示。图3为人体羊膜上皮细胞移植两个月的小鼠的卵巢产生的基本卵泡组织学 检测结果。治疗组小鼠产生绿色荧光蛋白阳性的卵泡，与对照组小鼠卵巢（对照组只注射 DMS0, η = 10)很类似。
[0030] 在测定移植的人体羊膜上皮细胞的存活和分化的实验中，使用人体核抗原进行免 疫组织化学分析，其结果如图4和图5所示，其中图4为利用人体抗原使用免疫化学方法检 测移植细胞人体卵泡刺激素受体表达的结果，图5为利用人体抗原使用免疫化学方法检测 在卵子周围的颗粒细胞中人体卵泡刺激素受体表达的结果。用人类促卵泡激素受体（FSHR) 来表示移植细胞的特征，FSHR，糖蛋白激素受体，可作为颗粒细胞标记物，是雌性正常卵巢 进化和卵泡成熟所必须的。此外，类促卵泡激素受体FSHR也可作跟踪标记人类细胞移植的 轨迹。所得实验结果显示：在接受绿色羊膜上皮细胞移植2个月后，受体小鼠（治疗组小 鼠）卵巢的部分卵泡中有人类特定核表达，而在没有接受人体羊膜上皮细胞移植小鼠（对 照组小鼠）的卵巢中人体特定核表达呈阴性，在治疗组小鼠卵子附近的颗粒细胞中也可检 测人体特定核表达，其他的颗粒细胞没有染色。采用免疫组织化学法排列测定，模拟人类促 卵泡激素受体染色，检测结果与人类特定的核抗体相似，在人体羊膜上皮细胞移植2个月 后只在与治疗组卵巢组织内受精卵临近的细胞中观测到人类促卵泡激素受体。受体的卵巢 切片用绿色荧光蛋白和人类特有的核抗原来进行双染色的结果如图6和图7所示，其中图6 为人体羊膜上皮细胞移植28天后使用绿色荧光蛋白和抗人核抗体染色的卵巢切片显示移 植的人体羊膜上皮细胞的检测结果。图7为人体绿色上皮细胞移植两个月后，在受体卵巢 的窦状卵泡中，绿色荧光蛋白染色与人体核抗体共同定位检测结果。上述实验结果充分证 明人体羊膜上皮细胞可以安全移植到卵巢功能衰退引起的不孕不育症的小鼠体内，并参与 卵泡的生成，恢复化疗治疗后的小鼠卵巢功能。
[0031 ] 应理解，在阅读了本发明的上述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种 改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
【主权项】
1. 一种羊膜上皮细胞在制备治疗不孕不育症药物中的用途。
2. 如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述羊膜上皮细胞来源于人类。
3. 如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述不孕不育症是由卵巢功能减退所引发 的不孕不育症。
4. 如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述不孕不育症是由于放射治疗引起的不 孕不育症。
5. 如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述不孕不育症是由于化疗引起的不孕不 育症。
6. 如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述不孕不育症是由于外科手术引起的不 孕不育症。
7. -种羊膜上皮细胞的培养方法，其特征在于，所述培养方法包括以下步骤：从胎盘 分离羊膜绒膜，将所得羊膜绒膜分割成切片，将该切片溶于乙二胺四乙酸形成羊膜细胞悬 液，将所得羊膜细胞悬液接种在细胞培养基中35°C -37°C培养即得。
8. 如权利要求7所述的培养方法，其特征在于，所述切片的面积为0. 5-1. Om 2。
9. 如权利要求6所述的培养方法，其特征在于，所述的细胞培养基为1640培养基，所 述1640培养基中包含10%葡萄糖，lOOU/mL链霉素，lOOU/mL青霉素以及0. 3mg/mL谷氨酸 盐，所述百分比为质量百分比。
10. 如权利要求6所述的培养方法，其特征在于，所述培养的培养温度为37°C，所述培 养的条件为CO2含量5%，所述百分比为体积百分比。
【专利摘要】本发明公开了一种羊膜上皮细胞在制备治疗不孕不育症药物中的用途。本发明所述羊膜上皮细胞能够有效治疗或者改善由于卵巢功能衰退所导致的不孕不育症，显著提高了卵巢功能衰退导致的不孕不育症患者体内卵泡的生成，而且羊膜上皮细胞的增殖是可控的，利用羊膜上皮细胞进行移植治疗是安全的，此外羊膜上皮细胞的来源非常广泛，不会产生伦理或者道德问题，因此本发明为今后临床治疗或者改善不孕不育症提供了新的有效选择。
【IPC分类】C12N5-073, A61K35-50, A61P15-08, A61K35-36
【公开号】CN104666346
【申请号】CN201510049891
【发明人】赖东梅, 张秋婉, 王茜, 尧晓芬, 郭礼和, 张传宇
【申请人】上海国联干细胞技术有限公司, 中国福利会国际和平妇幼保健院
【公开日】2015年6月3日
【申请日】2015年1月30日