纳米片抑制Aβ聚集的方法并解聚已形成的Aβ纤维聚集体的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于医药技术领域，具体涉及一种用WS2纳米片抑制Αβ聚集的方法并解聚已形成的Αβ纤维聚集体的方法。
【背景技术】
[0002]阿尔茨海默病(AD)是老年痴呆最为常见的形式之一。AD患者的临床症状主要表现为认知功能障碍、渐进性记忆减退、人格异常等。其病理学特征为脑内细胞外老年斑沉积以及细胞内神经原纤维缠结。其中老年斑的主要成分是淀粉样肽(amyloid β -peptide, A β ) ο大量研宄结果表明A β的过量产生和聚集是AD的关键病理事件。抑制Αβ的聚集行为并解聚已形成的Αβ纤维聚集体是预防以及治疗AD的有效途径。能够调控A β聚集过程并降低A β毒性的物质是治疗AD非常有前景的备选药物。
[0003]基于此，大量的肽类衍生物、有机小分子以及一些金属配合物被设计合成用于抑制Αβ的聚集或解聚已形成的Αβ纤维。然而，因其靶向性差、血脑屏障(BBB)渗透性低以及毒副作用较高等特点，绝大多数抑制剂仅表现出中等的抑制效果和微弱的解聚能力。因此迫切需要设计新型的化合物或材料用于抑制Aβ聚集并解聚Αβ纤维聚集体。近年来，纳米材料因其较大的比表面积和独特的光、电、磁学及催化活性等性质日益受到人们的广泛关注。纳米生物学将纳米科技和生命科学相融合，成为现代科学技术研宄的热点，在生物医学、电子学、材料学、环境科学等诸多领域具有良好的应用前景。大量研宄表明，纳米材料可以通过疏水相互作用、-31堆积作用、范德华力和静电相互作用等和生物大分子相互作用。纳米材料可以作为一种新型的药物试剂用于调控Αβ的聚集行为从而治疗AD。目前发现多种纳米材料可以抑制A β的聚集(Adv.Mater.2013，25，3780 - 3801.)，但这些纳米材料主要是通过其表面的电荷和基团来实现对A β聚集行为的调控作用。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是为了提供一种用WS2纳米片抑制Αβ聚集的方法并解聚已形成的Αβ纤维聚集体的方法，该方法能够极大的降低药物的毒副作用并提高选择性。
[0005]本发明首先提供一种用WS2纳米片抑制A β聚集的方法，该方法包括:
[0006]步骤一:制备WS2纳米片；
[0007]步骤二:将Αβ单体样品进行处理，然后将处理后的A β单体样品与胃民纳米片在缓冲溶液中，在37°C孵育抑制Αβ聚集。
[0008]优选的是，所述的对A β单体样品进行处理的方法为粉末溶解于六氟异丙醇中，置于4°C下震荡2-6个小时，用氮气流将六氟异丙醇吹干，然后溶解在缓冲溶液中，在4°C中静置6-12小时。
[0009]优选的是，所述的缓冲溶液为1mM HEPES, 150mM NaCl, pH 7.3。
[0010]本发明还提供一种用WS2纳米片解聚已形成的Αβ纤维聚集体的方法，该方法包括:
[0011]步骤一:制备WS2纳米片；
[0012]步骤二:将八0单体样品进行处理，然后将处理后的Aβ单体样品溶于缓冲液中，在37°C下孵育7天，得到Αβ纤维聚集体；
[0013]步骤三:将WS2m米片与A β纤维聚集体在37°C孵育20分钟后，近红外激光光照5min，对已形成的Αβ纤维聚集体进行解聚。
[0014]优选的是，所述的对A β单体样品进行处理的方法为:将Αβ粉末溶解于六氟异丙醇中，置于4°C下震荡2-6个小时，用氮气流将六氟异丙醇吹干，然后溶解在缓冲溶液中，在4°C中静置6-12小时。
[0015]优选的是，所述的缓冲溶液为1mM HEPES, 150mM NaCl, pH 7.3。
[0016]本发明的有益效果
[0017]本发明首先提供一种用WS2纳米片抑制Αβ聚集的方法，该方法利用过渡金属二硫化钨(WS2) 二维纳米材料抑制A β的聚集，WS2纳米片能够通过其平面基底与芳香族氨基酸之间的范德华力吸附Αβ单体，同时，WS2表面带负电，可以静电结合Αβ的阳离子簇区域，增强Αβ单体与WS2片层结构间的结合，抑制Αβ聚集；实验结果表明:WS2纳米片能够显著的抑制Αβ聚集，且其抑制效果呈浓度依赖性；WSJiAP单体的抑制作用在复杂体系如牛血清白蛋白(BSA)溶液和小鼠脑脊液(CSF)中仍然能够实现。
[0018]本发明还提供一种用WS2纳米片解聚已形成的Αβ纤维聚集体的方法，WS2纳米片在近红外区有着较高的光学吸收，利用其近红外吸收的性质，可以有效的光热消融癌细胞并减小小鼠的肿瘤尺寸，基于此，该方法利用WS2纳米片层结构并光热解聚已形成的Αβ纤维聚集体，与传统的化学治疗和辐射治疗相比，热疗的优势在于只有光照的病变部位才会产热，而其他的正常组织不受影响，能够极大的降低药物的毒副作用并提高选择性。实验结果表明:WS2纳米片具有明显的光热效果，在近红外光照射下能够有效的光热解聚已形成的Αβ纤维聚集体；同时，WS2m米片可以降低Αβ弓丨起的细胞毒性；WS 2对Aβ纤维聚集体的光热解聚作用在复杂体系如牛血清白蛋白(BSA)溶液和小鼠脑脊液(CSF)中仍然能够实现。
【附图说明】
[0019]图1为实施例1步骤一合成的WS2m米片原子力图；
[0020]图2为实施例lWS2m米片对Αβ 1-40聚集的抑制作用ThT荧光检测图；
[0021]图3为实施例1A β 1-40与WS2纳米片共孵育7天后的衰减全反射红外图谱；
[0022]图4为实施例1A β 1-40与WS2纳米片共孵育7天后的⑶光谱图；
[0023]图5为实施例1胃&纳米片对A β 1-40聚集影响的AFM形貌图；
[0024]图6为实施例2胃&纳米片对A β 1-40纤维聚集体的光热解聚作用ThT荧光检测图；
[0025]图7为实施例2胃&纳米片对A β 1-40纤维聚集体的光热解聚作用的⑶光谱图；
[0026]图8为实施例2WS2m米片对A β 1-40聚集影响的AFM形貌图；
[0027]图9为实施例3WS2m米片对Αβ 1-40聚集的抑制作用ThT荧光检测图；
[0028]图10为实施例4WS2m米片对A β 1-40纤维聚集体的光热解聚作用ThT荧光检测图；
[0029]图1lMTT法检测WS2m米片对Αβ 1-40引起的细胞毒性抑制图。
【具体实施方式】
[0030]本发明首先提供一种用WS2纳米片抑制A β聚集的方法，该方法包括:
[0031]步骤一:制备WS2纳米片；
[0032]步骤二:将Αβ单体样品进行处理，然后将处理后的A β单体样品与WS^米片在缓冲溶液中，在37°C孵育抑制Αβ聚集。
[0033]按照本发明，首先制备WS2m米片，WS2纳米片的制备方法为本领域常用的技术方法，没有特殊限制，优选为:在氮气环境下，将WS2粉末溶解在溶剂中，所述的溶剂为正丁基锂溶液或己烷溶液，2天后，用滤纸过滤混合物，并用己烷洗涤，所述的滤纸优选为ffhatman#41滤纸，将得到的半干状沉淀物中加入去离子水，超声处理I小时，然后将溶液离心，用去离子水洗涤3次去除锂离子和未分散的大颗粒，收集上清液，用去离子水透析5天，得到WS2m米片。所得到的WS 2纳米片的平均厚度为1.7nm，平均直径为200nm。
[0034]按照本发明，所述的对Αβ单体样品进行处理的方法优选为粉末溶解于六氟异丙醇中，置于4°C下震荡2-6个小时，使其全部溶解，将储备液于_20°C下保存，在使用之前，用氮气流将六氟异丙醇吹干，然后溶解在缓冲溶液中，在4°C中静置6-12小时。所述的缓冲溶液优选为 1mM HEPES, 150mM NaCl，pH 7.3。
[0035]按照本发明，将处理后的Αβ单体样品与不同浓度的WS2m米片在缓冲溶液中，在37°C孵育抑制Αβ聚集。所述的Αβ单体样品的浓度为50μΜ，WS2m米片的浓度为O-100 μ gmL—1，所述的缓冲溶液优选为 1mM HEPES, 150mM NaCl,pH 7.3。WS2^ A β 聚集的抑制能力通过硫磺素T(ThT)荧光光谱、圆二色谱(CD)、原子力(AFM)以及衰减全反射红外光谱(ATR-FTIR)手段表征。
[0036]WS2纳米材料表面结合Aβ单体，会降低溶液中单体的浓度，而Αβ的纤维化与单体浓度密切相关，降低单体浓度可以抑制Αβ聚集。同时，Αβ单体通过分子间相互作用形成寡聚体的过程是可逆的。单体浓度的降低会导致该反应向寡聚体解聚的方向进行，减少溶液中存在的聚集核心或种子的含量，从而有效地抑制其聚集过程。WS2纳米片层能够通过范德华力和静电相互作用吸附Αβ单体，从而达到抑制Αβ聚集的效果。
[0037]本发明还提供一种用WS2纳米片解聚已形成的Αβ纤维聚集体的方法，该方法包括:
[0038]步骤一:制备WS2纳米片；
[0039]步骤二:将八0单体样品进行处理，然后将处理后的Aβ单体样品溶于缓冲液中，在37°C下孵育7天，得到Αβ纤维聚集体；
[0040]步骤三:将WS2m米片与A β纤维聚集体在37°C孵育20分钟后，近红外激光光照5min，对已形成的Αβ纤维聚集体进行解聚。
[0041]按照本发明，首先制备WS2m米片，WS2纳米片的制备方法为本领域常用的技术方法，没有特殊限制，优选为:在氮气环境下，将WS2粉末溶解在溶剂中，所述的溶剂为正丁基锂溶液或己烷溶液，2天后，用滤纸过滤混合物，并用己烷洗涤，所述的滤纸优选为ffhatman#41滤纸，将得到的半干状沉淀物中加入去离子水，超声处理I小时，然后将溶液离心，用去离子水洗涤3次去除锂离子和未分散的大颗粒，收集上清液，用去离子水透析5天，得到WS2m米片。所得到的WS 2纳米片的平均厚度为1.6nm，平均直径为200nm。
[0042]按照本发明，所述的对Αβ单体样品进行处理的方法优选为:将Αβ粉末溶解于六氟异丙醇中，置于4°C下震荡2-6个小时，使其全部溶解，将储备液于_20°C下保存，在使用之前，用氮气流将六氟异丙醇吹干，然后溶解在缓冲溶液中，在4°C中静置6-12小时。所述的缓冲溶液优选为 1mM HEPES, 150mM NaCl，pH 7.3。
[0043]按照本发明，将上述处理后的A β单体样品溶于缓冲液中，在37°C下孵育7天，得到Αβ纤维聚集体；所述的缓冲溶液优选为1mM HEPES, 150mM NaCl，pH 7.3。将WS2m米片与Αβ纤维聚集体在37°C孵育20分钟后，近红外激光光照5min，对已形成的Αβ纤维聚集体进行解聚。所述的近红外激光强度为lWcnT2;WS2对光热解聚Αβ纤维聚集体的效果通过硫磺素T (ThT)荧光光谱、圆二色谱(CD)、原子力(AFM)以及衰减全反射红外光谱(ATR-FTIR)手段表征，对A β聚集体引起的细