软骨细胞增殖促进剂的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及软骨细胞增殖促进剂、软骨障碍的预防或改善剂、及关节痛等软骨相 关疾病的预防或改善剂，详细而言涉及以蛋黄蛋白水解物为有效成分的软骨细胞增殖促进 剂、软骨障碍的预防或改善剂、及关节痛等软骨相关疾病的预防或改善剂。
【背景技术】
[0002] 在各种软骨疾病的预防及治疗的过程中，软骨细胞的增殖、分化功能的表达是重 要的。即，通常认为软骨细胞的增殖、成熟化引起了骨的正常成长以及骨折时的修复。作 为软骨细胞增殖的诱导因子，已经报道了 TGF - |3 1(Transforming Growth Factor:转 化生长因子）、IGF - I (Insulin-like Growth Factor:膜岛素样生长因子）、bFGF(basic Fibroblast Growth Factor:喊性成纤维细胞生长因子）、PTHrP (PTH-related peptide: 甲状旁腺素相关蛋白）、HGF(Hepatocyte Growth Factor:肝细胞生长因子）、BMP(bone morphogenetic protein，骨形态发生蛋白）等。但是，安全性、稳定性、有效性优异的软骨 细胞增殖促进药的临床应用尚未建立起来。
[0003] 软骨疾病中，患者数最多的疾病为变形性关节症。通常认为其原因之一是年龄增 长，预期今后的高龄化社会中本症例会增加。在关节疾病等以软骨变性为主要病变的软骨 障碍的预防和治疗中，一直以来主要使用雌激素、降钙素等骨吸收抑制物质、阿司匹林、非 甾类消炎剂（NSAID)，但这样的方法不仅无法获得充分的效果，而且已知具有消化道障碍等 有害作用。因此，强烈需要一种在软骨损伤、软骨障碍的治疗中能够安全使用的预防或改善 剂。
[0004] 另一方面，本申请的发明人等一直在研宄蛋黄蛋白水解物的功能，发现其具有抗 氧化作用（专利文献1)、骨强化作用（专利文献2)等。但是，蛋黄蛋白对软骨的作用尚没 有报道。
[0005] 现有技术文献
[0006] 专利文献
[0007] 专利文献1:日本特开2001 - 328919号公报
[0008] 专利文献2:国际公开第W02006/075558号
【发明内容】
[0009] 发明要解决的课题
[0010] 本发明的课题在于，提供一种在软骨损伤、软骨障碍等软骨相关疾病的预防、改善 或治疗中能够安全使用的新颖的有效成分。
[0011] 用于解决课题的手段
[0012] 本发明为了解决上述课题而包含以下的各发明。
[0013] [1] 一种软骨细胞增殖促进剂，其特征在于，含有蛋黄蛋白水解物作为有效成分。
[0014] [2] -种软骨障碍和/或关节痛的预防或改善剂，其特征在于，含有蛋黄蛋白水解 物作为有效成分。
[0015] [3] -种含有前述[1]所述的软骨细胞增殖促进剂的药物，其为用于软骨障碍和/ 或关节痛的预防或治疗的药物。
[0016] [4] 一种含有前述[1]所述的软骨细胞增殖促进剂的补充剂，其为用于软骨障碍 和/或关节痛的预防或改善的补充剂。
[0017] [5] -种含有前述[1]所述的软骨细胞增殖促进剂的食品添加剂，其为用于软骨 障碍和/或关节痛的预防或改善的食品添加剂。
[0018] [6]蛋黄蛋白水解物用于制作软骨细胞增殖促进剂的用途。
[0019] [7]蛋黄蛋白水解物用于制造软骨障碍和/或关节痛的预防或改善剂的用途。
[0020] [8] -种非治疗目的的软骨障碍或关节痛的预防或改善方法，其特征在于，使有软 骨细胞增殖促进需求的人经口摄取蛋黄蛋白水解物。
[0021] [9] 一种软骨细胞增殖促进剂的制造方法，其特征在于，包括：对蛋黄进行脱脂处 理的工序、将获得的脱脂蛋黄用蛋白水解酶水解而获得蛋黄蛋白水解物的工序、使获得的 蛋黄蛋白水解物作为有效成分而含有的工序。
[0022] 发明的效果
[0023] 根据本发明，能够提供软骨细胞增殖促进剂、软骨障碍的预防或改善剂、及关节痛 的预防或改善剂。作为有效成分的蛋黄蛋白水解物为来自于天然物质的安全物质，因此能 够广泛用作日常能够摄取的饮食品、药物、饲料等。
【附图说明】
[0024] 图1为表示实施例1中制造的蛋黄蛋白水解物的利用凝胶过滤色谱获得的分子量 分析的结果图。
[0025] 图2为表示将兔子软骨缺损模型的膝关节缺损处置部的石蜡切片进行阿辛蓝 (Alcian blue)染色并将阿辛蓝染色面积与对照组比较的结果图。
[0026] 图3为表示将兔子软骨缺损模型的膝关节缺损处置部的石蜡切片进行番红0染色 并将番红0染色面积与对照组比较的结果图。
[0027] 图4为表示服用蛋黄蛋白水解物所产生的、膝关节痛患者的疼痛改善效果的研宄 结果图。
[0028] 图5为表示实施例1中制造的蛋黄蛋白水解物的利用凝胶过滤色谱获得的分子量 分析的结果图。
[0029] 图6为对实施例1中制造的蛋黄蛋白水解物进行分级而获得的分级物的、利用凝 胶过滤色谱获得的分子量分析的结果图。
【具体实施方式】
[0030] 本发明提供含有蛋黄蛋白水解物作为有效成分的软骨细胞增殖促进剂、软骨障碍 和/或关节痛的预防或改善剂。
[0031] 蛋黄蛋白水解物没有特别限定，优选将蛋黄蛋白水解而获得。用作蛋黄蛋白水解 物的原料的蛋黄，可以列举鸡、鸭、鹌鹑等的蛋黄，从生产性的观点出发，优选使用鸡的蛋 黄。蛋黄可以使用蛋黄液、蛋黄粉末、脱脂蛋黄粉末等，其中优选使用蛋黄粉末、脱脂蛋黄粉 末。此外，从资源的有效利用、成本的观点出发，优选使用由蛋黄制造蛋黄油、蛋黄卵磷脂时 作为副产物产生的脱脂蛋黄。蛋黄的脱脂处理优选使能够用于食品加工的有机溶剂（例 如，乙醇、异丙醇、己烷等中的至少一种）作用于蛋黄而实施。从简便性和安全性的观点出 发，优选使用乙醇。
[0032] 作为用于将蛋黄蛋白水解的蛋白水解酶，没有特别限定，优选具有蛋白酶活性或 羧肽酶活性且能够用于食品制造的酶。例如，可以列举胃蛋白酶（EC. 3. 4.23. 1)、胰蛋白 酶（EC. 3. 4. 21. 4)、凝乳酶（EC. 3. 4. 23. 15)、包含凝乳酶的用于乳酪用途的干胃膜、羧肽 酶A(EC. 3.4. 17. 1)、来自杆菌属细菌的蛋白酶（商品名"Alcalase"诺维信公司制、商品名 "OrientaseSSBF'TiBI Enzymes Inc.制、商品名"^ 夕 シy'?BI Enzymes Inc.制、商品 名"蛋白酶S 'Amamo'G" Amano Enzyme inc.制、商品名"THERMOASE PC10"大和化成株式 会社制等）、来自曲霉菌属菌的蛋白酶（商品名"Orientase 0NS"HBI Enzymes Inc.制、商 品名"Orientase 20A"HBI Enzymes Inc.制、商品名"蛋白酶 P 'Amamo'3G"Amano Enzyme inc.制、商品名"Flavourzyme"诺维信公司制等）等。蛋白水解酶既可以仅使用1种，也可 以将2种以上组合使用。优选来自杆菌属细菌的蛋白酶、胃蛋白酶或它们的组合。
[0033] 蛋白水解酶的浓度根据所使用的原料蛋黄及酶而适当改变，在使用脱脂蛋黄作为 原料时，酶和脱脂蛋黄的质量比优选在约1 :20~约I :1000的范围。此外，酶反应温度、反 应时间也根据所使用的原料蛋黄及酶而不同，优选在约25~约75°C下进行约1~约24小 时的水解。
[0034] 获得的蛋黄蛋白水解物可以适当脱盐后直接使用。此外，也可以通过使用超滤膜、 凝胶过滤、各种柱色谱、膜滤器、等电点的方法等进行精制、分级后使用。例如，可以通过实 施例2所述的方法来确认精制、分级后的蛋黄蛋白水解物具有软骨细胞增殖促进作用。
[0035] 获得的蛋黄蛋白水解物的、利用凝胶过滤色谱进行的分子量分布分析中，相对于 蛋白质、肽、氨基酸的面积比的总和，优选分子量为约100以上且约20, 000以下的部分的 面积比占约65 %以上，更优选前述面积比占约75 %以上，进而优选前述面积比占约85 %以 上，进而优选前述面积比占约90 %以上。
[0036] 此外，作为更优选的蛋黄蛋白水解物，可以列举如下蛋黄蛋白水解物：通过使用分 子量1，〇〇〇的超滤膜的分级而获得，在利用凝胶过滤色谱进行的分子量分布分析中，相对 于蛋白质、肽、氨基酸的面积比的总和，分子量为约500以上且约20, 000以下的部分的面积 比占约85%以上、优选约90%以上。
[0037] 这样获得的蛋黄蛋白水解物具有软骨细胞增殖促进作用、软骨障碍的预防、治疗 或改善作用、关节痛的预防、治疗或改善作用等，因此能够适合作为软骨细胞增殖促进剂、 软骨障碍的预防、治疗或改善剂、及关节痛的预防、治疗或改善剂等的有效成分使用。作为 软骨障碍，可以列举例如变形性关节症、软骨的缺损、软骨损伤、半月板损伤等。
[0038] 本发明的软骨细胞增殖促进剂、软骨障碍和/或关节痛的预防或改善剂中，蛋黄 蛋白水解物的含量没有特别限定，优选含有蛋黄蛋白水解物约〇. 05~约50质量％，更优选 含有约0. 1~约25质量％。此外，蛋黄蛋白水解物的每天施予量根据施予对象而不同，例 如在对象为成人时，通常为约0. 05~约2000mg/天，优选为约0. 1~约1000 mg/天。
[0039] 本发明提高用于软骨障碍和/或关节痛的预防或治疗的药物。本发明的药物只要 含有上述本发明的软骨细胞增殖促进剂即可。本发明的药物可以通过经口或非经口的任意 途径施予至哺乳动物。作为经口剂，可以列举颗粒剂、散剂、片剂（包括糖衣片）、丸剂、胶囊 剂、糖浆剂、乳剂、悬浊剂等。作为非经口剂，可以列举注射剂（例如，皮下注射剂、静脉内注 射剂、肌肉内注射剂、腹腔内注射剂）、点滴剂、外用剂（例如，经鼻施予制剂、经皮制剂、软 膏剂）、栓剂（例如，直肠栓剂、肛栓剂）等。这些制剂可以通过本领域通常使用的手法利用 药学上允许的载体而制剂化。作为药学上允许的载体，可以列举赋形剂、结合剂、稀释剂、