疫苗。分析条件：流动相为20mM的磷酸缓冲液（pH 7. 4)，流 速〇. 5毫升/分钟，检测波长为280纳米。
[0031] 图3? NMR分析多糖结合疫苗。1H-NMR分析由Bruker 600MHz核磁共振仪完成。
[0032] 图4多糖结合疫苗产生的多糖特异性抗体。图a为多糖特异性的IgG抗体滴度； 图b为多糖特异性的IgGl抗体滴度；图c为多糖特异性的IgG2a抗体滴度；图d为多糖特 异性的IgG2a/IgGl。多糖特异性抗体滴度由ELISA方法测定。
[0033] 图5多糖特异性抗体的免疫持效性。通过测定三针免疫后18周内多糖特异性IgG 的滴度，来研宄多糖特异性抗体的免疫持效性。多糖特异性IgG滴度由ELISA方法测定。
[0034] 图6多糖结合疫苗产生的多糖特异性抗体的特异性。
【具体实施方式】：
[0035] 实施例1 :多糖结合疫苗的制备
[0036] 连接桥不含PEG的多糖结合疫苗（PS-TT)、以PEG2K为连接桥的多糖结合疫苗 (PS-P2K-TT)、以PEG5K为连接桥的多糖结合疫苗（PS-P5K-TT)的制备反应如图1所示。将 IOmg Y群脑膜炎球菌荚膜多糖溶于2ml生理盐水中，加入20 y L溴化氰溶液（w/v 50% ) 进行活化，室温反应1小时。活化过程中，用0.5M NaOH维持溶液的pH值为10.5。活化结 束后，用0.5M的盐酸调节溶液的pH值至8. 5,终止反应。随后分别加入IOmg N-2-胺乙 基-马来酰亚胺，60mg胺-PEG2K-马来酰亚胺（PEG分子量为2kDa)和75mg胺-PEG5K-马 来酰亚胺（PEG分子量为5kDa)。于室温反应过夜。反应结束后，用截留分子量为50kDa的 滤膜于6000g离心5次，除去未反应的小分子，获得3种带马来酰亚胺基团（mal)的多糖活 化产物，即 PS-mal、PS-P2K-mal 和 PS-P5K-mal。
[0037] 将破伤风类毒素（TT)与2-亚氨基硫烷以摩尔比I:30混合，反应pH值为7. 4,于 室温下反应12小时，2-亚氨基硫烷会将破伤风类毒素分子的氨基转化成巯基。用截留分子 量为50kDa的滤膜于6000g离心5次，除去未反应的2-亚氨基硫烷。巯基化的破伤风类毒 素分别与PS-mal、PS-P2K-mal和PS-P5K-mal的马来酰亚胺基团反应。巯基化的破伤风类 毒素与活化的多糖以质量比1:1混合，反应PH值为7. 4,于4°C下反应24小时，得到三种多 糖结合疫苗，即 PS-TT、PS-P2K-IT 和 PS-P5K-TT。
[0038] 实施例2 :对三种多糖结合疫苗的表征
[0039] 将实施例1所涉及的多糖_蛋白结合产物，用Superdex 200凝胶过滤柱 (2. 6cmX 60cm)进行分离纯化，洗脱液为20mM的磷酸缓冲液（pH 7. 4)，流速为3毫升/分 钟。分别收集对应于PS-TT、PS-P2K-TT和PS-P5K-TT的洗脱峰。
[0040] 以Superdex 200凝胶过滤柱（1.0 cmX 30cm)对纯化产品进行鉴定，洗脱液为20mM 的磷酸缓冲液（pH 7. 4)，流速为0.5毫升/分钟。如图2所示，与载体蛋白相比，PS-TT、 PS-P2K-TT和PS-P5K-TT的出峰时间明显提前。这表明载体蛋白与肺炎荚膜多糖结合后，分 子量显著增加。由于三种结合产物均在凝胶过滤柱的外水体积出峰，三种结合产物的出峰 时间一致。
[0041] 用1H-NMR进行检测多糖结合疫苗。如图3所示，与荚膜多糖分子相比，PS-TT、 PS-P2K-TT和PS-P5K-TT在0. 4-1. 4ppm处出现了特征峰，对应于载体蛋白的脂肪链氨基酸 残基。在7. 2ppm处出现了对应于载体蛋白的芳香族氨基酸残基的特征峰。这表明荚膜多糖 分子成功地偶联了载体蛋白。如图3插图所示，PS-TT、PS-P2K-TT和PS-P5K-TT在6. 2ppm 处出现了对应于琥珀酰亚胺的特征峰，这表明多糖结合疫苗的连接桥中含有琥珀酰亚胺。 此外，由于PEG分子中大量亚甲基的存在，PS-P2K-TT和PS-P5K-TT在3. 6ppm处的特征峰 强度要远大于PS-TT。这表明PS-P2K-TT和PS-P5K-TT的连接桥中PEG分子。因此，荚膜多 糖在结合载体蛋白前后，其结构未发生明显改变。
[0042] 实施例3 :多糖结合疫苗免疫原性的测定
[0043] 选取32只5周龄的雌性Blab/C小鼠，体重为15-22克。随机分为4组，即荚膜多 糖组、PS-TT组、PS-P2K-TT组和PS-P5K-TT组，每组8只小鼠。腹腔注射，每只每次注射含 有5微克多糖，每周注射1次，共注射3次。21天后眼眶取血。用ELISA法检测小鼠血浆中 抗荚膜多糖的IgG、IgGl和IgG2a。
[0044] 如图4所示，荚膜多糖组产生的抗荚膜多糖的IgG和IgGl滴度较弱，而IgG2a未检 测到。荚膜多糖与载体蛋白偶联后抗体滴度显著增加。与荚膜多糖组相比，PS-TT组抗荚膜 多糖的IgG和IgGl的抗体滴度分别是荚膜多糖组的37. 1倍和58. 6倍。PS-P2K-TT组产生 的抗荚膜多糖抗体滴度要显著高于PS-TT组，其中IgG、IgGl和IgG2a的抗体滴度分别分别 是PS-IT组的2.5倍、2.4倍和6.0倍。？5呼51(-1'1'组产生的抗荚膜多糖1 §6、1§61和1§62& 的抗体滴度分别分别是PS-TT组的1. 6倍、1. 4倍和10. 9倍。PS-P2K-TT组和PS-P5K-TT 组的IgG2a/IgGl分别是PS-TT组的2. 9倍和9. 1倍。这表明PEG能增强多糖结合疫苗的 Thl型免疫应答。
[0045] 实施例4 :多糖特异性抗体的免疫持效性
[0046] 通过测定三针免疫后18周内多糖特异性抗体的滴度，来研宄多糖特异性抗体的 免疫持效性。如图5插图所示，荚膜多糖组产生的多糖特异性IgG滴度较低，随着注射时 间增加而逐渐降低，第4周后已无法检测到。如图5所示，PS-P5K-TT组产生的多糖特异性 IgG滴度要低于PS-P2K-TT组，而高于PS-TT组。三种结合产物的多糖特异性IgG滴度在第 2周达到峰值，在第4-18周内逐渐下降，其中PS-TT组的下降速度最快。第18周后，PS-TT 组、PS-P2K-TT组和PS-P5K-TT组的多糖特异性IgG滴度分别是其峰值的11. 9%，23. 0% 和19. 2%。因此，PEG能够增强多糖特异性抗体的免疫持效性。
[0047] 实施例5 :多糖特异性抗体的特异性和亲合性
[0048] 向200倍稀释的PS-IT组、PS-P2K-IT组和PS-P5K-IT组小鼠血浆中加入不同量 的荚膜多糖，用ELISA方法检测小鼠血浆中抗荚膜多糖的抗体水平。如图6所示，随着多糖 加入量的增加，多糖特异性抗体结合96孔板中多糖的能力逐渐降低。当加入的多糖达到 15yg时，抗体结合多糖的能力丧失。这表明小鼠产生的抗荚膜多糖抗体能够特异性地结合 荚膜多糖。
[0049] 用硫氰酸铵法测定抗荚膜多糖的抗体亲合性。荚膜多糖组的多糖特异性抗体亲 和指数为I. 18mol/L，而PS-TT组、PS-P2K-TT组和PS-P5K-TT组的抗体亲和指数分别为 2. 25mol/L、2. 09mol/L和2. 16mol/L。这表明结合载体蛋白能显著提高多糖特异性抗体的 亲合性。
【主权项】
1. 一种脑膜炎球菌多糖结合疫苗的制备方法，其特征在于，制备的步骤包括：（1)脑膜 炎球菌荚膜多糖先由溴化氢（CNBr)进行活化，然后与N-2-胺乙基-马来酰亚胺进行衍化 反应；（2)载体蛋白与2-亚氨基硫烧（2-iminothiolane)反应，生成带有疏基基团的载体 蛋白；(3)衍化多糖所带的马来酰亚胺基团与载体蛋白所带的巯基基团反应，得到脑膜炎 球菌荚膜多糖与载体蛋白的共价结合物。
2. 根据权利要求1所述的N-2-胺乙基-马来酰亚胺，结构式为
3. 根据权利要求1所述的脑膜炎球菌荚膜多糖为A群、C群、W 135群和Y群流行性脑脊 髓膜炎奈瑟氏球菌荚膜多糖。
4. 根据权利要求1所述的载体蛋白为破伤风类毒素。
5. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于衍化反应在室温下进行6-24小时。脑 膜炎球菌荚膜多糖与N-(2-氨乙基）马来酰亚胺的质量比为1:1。
6. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，载体蛋白与2-亚氨基硫烷的摩尔比 为 1:10〇
7. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在衍化的脑膜炎球菌荚膜多糖与巯 基化的载体蛋白结合步骤中，脑膜炎球菌荚膜多糖和载体蛋白的质量比为1:1 ;于4°C下反 应12-36小时。
8. -种脑膜炎球菌多糖结合疫苗，其特征在于，所述的脑膜炎球菌多糖结合疫苗由根 据权利要求1-7任一项所述的制备方法制得。
【专利摘要】本发明提供了一种以含PEG的异型双功能试剂作桥连剂的新型多糖结合疫苗制备技术，并基于此技术，开发出了脑膜炎球菌多糖结合疫苗，此技术的优势在于：(1)避免了传统工艺中多糖和蛋白质各自的自身交联，提高了产率，也利于质量控制；(2)长的PEG链可增大多糖和蛋白质之间的距离，降低两者之间相互的空间屏蔽效应，提高多糖结合疫苗的免疫原性。
【IPC分类】A61K39-095, A61K39-385, A61P31-04
【公开号】CN104815326
【申请号】CN201510184614
【发明人】胡涛, 安文琪, 苏志国, 范蓓, 黄庆瑞, 马小伟, 潘若文
【申请人】中国科学院过程工程研究所, 华兰生物工程股份有限公司, 华兰生物疫苗有限公司
【公开日】2015年8月5日
【申请日】2013年2月6日
【公告号】CN103083652A