压缩胶原-静电纺丝膜-压缩胶原复合支架及制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及组织支架及其制备方法，尤其涉及一种用于组织移植的压缩胶原-静电纺丝膜-压缩胶原复合支架，并涉及这种复合支架的制备方法。
【背景技术】
[0002]胶原蛋白是组织最主要的结构蛋白，是制作组织支架的最佳天然材料。但是，传统支架制作方法构建的胶原蛋白支架力学强度差，且支架纤维定向程度低，与正常组织结构相比仍有较大的差距。
【发明内容】
[0003]本发明的目的是提供一种压缩胶原-静电纺丝膜-压缩胶原复合支架及制备方法，以解决传统支架制作方法构建的胶原蛋白支架存在的上述技术问题中的至少一个。
[0004]本发明的具体技术方案为:
[0005]一种压缩胶原-静电纺丝膜-压缩胶原复合支架，该复合支架由一个聚乙烯醇电纺膜片和两个压缩胶原支架组成，所述聚乙烯醇电纺膜片上均匀设置若干小孔，所述若干小孔的直径为10-80 μ m，孔间距为50-200 μ m，所述两个压缩胶原支架相对应地设置在所述聚乙烯醇电纺膜片的两个表面，与所述聚乙烯醇电纺膜片构成三层结构的复合支架，压缩胶原支架含有基质细胞。
[0006]在上述的压缩胶原-静电纺丝膜-压缩胶原复合支架中，优选地，所述聚乙烯醇电纺膜片由多层纳米纤维构成。
[0007]在上述的压缩胶原-静电纺丝膜-压缩胶原复合支架中，优选地，构成所述聚乙烯醇电纺膜片的多层纳米纤维，在单层中纤维定向排列，不同层的纤维成角度交错排列。
[0008]一种压缩胶原-静电纺丝膜-压缩胶原复合支架的制备方法，该制备方法包括以下步骤:
[0009]制备聚乙烯醇电纺膜片，并在膜片上成型若干小孔；
[0010]配制含基质细胞的胶原溶液，装入模具，塑形，制得含基质细胞的胶原支架；
[0011]在模具中，以所述聚乙烯醇电纺膜片为中间层，两个含基质细胞的胶原支架分别为顶层和底层，构成复合支架；以及
[0012]将复合支架压缩至指定厚度。
[0013]在上述的压缩胶原-静电纺丝膜-压缩胶原复合支架的制备方法中，优选地，该制备方法还包括:在所述的将复合支架压缩至指定厚度的步骤之后，将复合支架置于基质细胞培养液中一段时间，进行细胞培养的步骤。
[0014]在上述的压缩胶原-静电纺丝膜-压缩胶原复合支架的制备方法中，优选地，所述的制备聚乙烯醇电纺膜片，并在膜片上成型若干小孔的步骤中，采用具有平行双薄碟定向纤维收集装置和纤维收取装置的静电纺丝设备制备聚乙烯醇电纺膜片，具体包括:
[0015]配制质量浓度为8% -12%的聚乙烯醇溶液，注入静电纺丝设备的注射器中；
[0016]设置静电纺丝设备的参数为:溶液流速为0.4-0.8mL/h，电压为12-18KV，注射器针尖与收集装置之间的距离为140-190_ ;以及
[0017]控制所述纤维收集装置、纤维收取装置以及电纺时间，制得所述聚乙烯醇电纺膜片。
[0018]在上述的压缩胶原-静电纺丝膜-压缩胶原复合支架的制备方法中，优选地，所述的控制所述纤维收集装置、纤维收取装置以及电纺时间，制得所述聚乙烯醇电纺膜片的步骤中，包括:控制两个薄碟之间的电场，实现纤维的定向收集；和/或
[0019]控制纤维收取装置周期性转动并控制转动角度，以收集到单层纤维定向排列、不同层的纤维成角度交错排列的多层纳米纤维膜；和/或
[0020]控制电纺时间，以获得相应厚度的多层纳米纤维膜。
[0021 ] 在上述的压缩胶原-静电纺丝膜-压缩胶原复合支架的制备方法中，优选地，所述平行双薄碟定向纤维收集装置的薄碟的转速介于200-1000rpm之间可调节，两个薄碟之间的距离介于38-50mm之间可调节。通过控制两个薄碟之间的距离，可以控制收集的纳米纤维膜的长度，从而可以根据病患特点定制定长膜片。
[0022]在上述的压缩胶原-静电纺丝膜-压缩胶原复合支架的制备方法中，优选地，所述的配制含基质细胞的胶原溶液，装入模具，塑形，制得含基质细胞的胶原支架的步骤中，包括:将2.06mg/mL无菌I型胶原溶液、10MEM培养液、以及2.0X 105/mL基质细胞悬液充分混合，调整溶液PH值至中性，然后装入模具，放入培养箱中塑形，制得含基质细胞的胶原支架；
[0023]所述的将复合支架压缩至指定厚度的步骤中，包括:将复合支架转移到无菌吸水滤纸上，在复合支架的上下表面都铺上无菌滤纱，在上层滤纱表面置盖玻片，在盖玻片上置重物压缩复合支架，压缩至指定厚度后移去重物、盖玻片及滤纱，收集制作好的复合压缩支架。
[0024]在上述的压缩胶原-静电纺丝膜-压缩胶原复合支架的制备方法中，优选地，所述的配制含基质细胞的胶原溶液，装入模具，塑形，制得含基质细胞的胶原支架的步骤中，包括:根据需要调节胶原溶液中基质细胞的密度，以最终获得相应细胞密度的压缩胶原支架。
[0025]在上述的压缩胶原-静电纺丝膜-压缩胶原复合支架的制备方法中，优选地，所述的制备方法进一步还包括:设置胶原支架及聚乙烯醇电纺膜片的厚度比例或在制备胶原支架的胶原溶液中添加生物活性材料，以控制复合支架的降解速度。
[0026]本发明具有以下有益效果:
[0027]本发明结合静电纺丝技术和压缩支架技术，以胶原和PVA为主要材料，构建了含基质细胞的新型压缩胶原-PVA电纺膜-压缩胶原(三明治结构)的复合支架。该复合支架具有很好的力学性能和高的仿生性能，可以模拟天然组织的结构与性能。
[0028]其中的定向/非定向PVA电纺膜膜厚可控，且可达毫米级厚度，可有效模拟组织的结构；构建出的含基质细胞的、新型压缩胶原-PVA定向电纺膜-压缩胶原复合支架材料中基质细胞存活率高于90% ;并最终通过承载上皮干细胞，进行板层移植，移植效果良好。
【附图说明】
[0029]图1为一些实施例中采用的静电纺丝设备的结构示意图；
[0030]图2为一些实施例中胶原凝胶形成过程的示意图；
[0031]图3为一些实施例中支架压缩过程的示意图。
[0032]图中标记说明如下:1_接地线；2_高压电源；3_注射器；4-电纺溶液；5_纳米纤维；6_定向纤维收集装置；7_胶原溶液；8_基质细胞；9_金属模具；10_胶原凝胶。
【具体实施方式】
[0033]下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。这些更详细的描述旨在帮助理解本发明，而不应被用于限制本发明。根据本发明公开的内容，本领域技术人员明白，可以不需要一些或者所有这些特定细节即可实施本发明。而在其它情况下，为了避免将发明创造淡化，未详细描述众所周知的内容。
[0034]下面的一些实施例中，结合静电纺丝技术与压缩支架技术，以I型胶原和聚乙烯醇(PVA)为主要材料，构建含有基质细胞的新型压缩胶原-PVA电纺膜-压缩胶原(三明治结构)的复合支架，用于组织移植。聚乙烯醇(PVA)材料具有很好的生物相容性和降解性，并且通过静电纺丝技术电纺的PVA纳米纤维膜具有很好的力学性能，同时，通过控制静电纺丝设备，可以收集到膜厚可控，且厚度可到毫米级的非定向以及单层纤维定向排列，层与层纤维间成角度交错排列的定向纳米纤维膜。因此将静电纺丝技术与压缩支架技术结合起来，以I型胶原和PVA为主要材料，构建的含基质细胞的新型压缩胶原-PVA电纺膜-压缩胶原(三明治结构)的复合支架具有很好的力学性能和高的仿生性能，可以模拟天然组织的结构与性能。
[0035]实施例一:定向PVA纳米纤维膜，接种角膜基质细胞和上皮细胞，构建组织工程角膜。
[0036]具体制备方法包括以下步骤:
[0037](I)、利用图1所示的静电纺丝设备制备单层纤维定向排列，不同层的纤维成角度交错排列，膜厚可控，且厚度可到毫米级的PVA纳米纤维膜片(即聚乙烯醇电纺膜片)，并在膜片上成型若干小孔。具体如下:
[0038]将聚乙烯醇固体颗粒在80°C蒸馏水中搅拌4h，配制成质量浓度10%的PVA溶液，置于20mL的注射器中，与注射泵相连，注射器针头为23G(内径0.34mm);
[0039]设置静电纺丝设备的参数为:溶液流速为0.6mL/h，电压为15KV，注射器针尖与收集装置之间的距离为145mm，电纺时间为9h。上述参数下得到的PVA纳米纤维支架定向程度为96%，厚度为300 μπι；
[0040]利用激光器在PVA膜片上均匀打孔，孔的直径为50 μ m，孔间距为150 μ m。
[0041](2)、配制含基质细胞的胶原溶液，装入模具，塑形，制得含基质细胞的胶原支架。具体的，参照图2，将无菌I型胶原溶液(2.06mg/mL)、10MEM培养液、基质细胞悬液(2.0 XlOVmL)充分混合，混合液体积0.9mL，调整溶液pH值至中性，将溶液移入预先定制的金属模具9中，置于培养箱中塑形20min，得到300 μ m厚的胶原凝胶(胶原支架)10，使用相同的方法，得到另一个相同的含基质细胞的胶原凝胶。
[0042](3)、在金属模具中，以上述制备的两个胶原凝胶分别做底层和顶层，以制备的PVA纳米纤维膜做中间层，得到含基质细胞的胶原凝胶-PVA电纺膜-胶原凝胶的复合支架，复合支架厚度为900 μ m。
[0043](4)、将复合支架压缩至指定厚度。具体的，如图3所示，将上述复合支架转移到无菌吸水滤纸上，复合支架的上下表面都铺上无菌滤纱(主要起保护作用)，在上层滤纱表面置盖玻片，在盖玻片上置重物压缩塑形好的复合支架至500 μ m，移去重物、盖玻片及滤纱，收集制作好的复合压缩支架。
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