磁性静电纺丝纤维给癌症细胞加热的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及药物技术领域，具体涉及一种磁性静电纺丝纤维抗癌及制备方法。
【背景技术】
[0002]癌症是导致死亡的主要原因，一个正常的细胞转变成肿瘤细胞通常是通过一个多阶段的过程。在过去的十年中，对肿瘤的分子分析增强了我们对癌症的认识并且给我们提供了治疗癌症的新途径。但是，癌症的复杂性和不同类型癌症细胞的广泛变异，使得我们目前找到一个最佳治疗癌症手段或适合治疗普遍癌症的方法都变得很困难。常见的癌症化疗或放疗的应用的选择性和靶向性都很差，给人体造成非常严重的副作用。为了提高治疗的靶向性，研究人员开始转向纳米技术领域，例如，以胶束、脂质体等脂质为基础来实现药物输送系统。
[0003]对癌症治疗特别有效的就是含氧化铁的纳米粒子(1NPs)。磁性氧化铁纳米颗粒的确有杰出的治疗潜力，它可施加交变磁场也可以加热周围环境(即所谓的“磁热疗”)。当癌细胞暴露于升高的温度(例如45°C)时会发生失活并且最终会导致癌症细胞的的死亡。在乔丹等人开创性的工作下磁性氧化铁纳米颗粒可诱导升温的能力得到了明确地阐述。从此，通过磁性氧化铁纳米颗粒的磁热疗技术对癌症治疗的探索得到了很多的关注并且进行了很多的临床试验。目前正在进行的磁热疗有，复发性多形性胶质母细胞瘤患者已接受磁热疗。还要注意的是当氧化铁芯在体内破坏后，产生的游离铁与大多数的细胞都具有生物相容性。
[0004]虽然在静脉注射后，氧化铁纳米颗粒对肿瘤细胞的靶向性只是一定程度上的，在肿瘤局部精准的递送1NPs仍然是一个重大的挑战。但事实上，在静脉注射后大多数的纳米粒子被网状内皮系统迅速的清除，而网状内皮系统可能需要直接注射1NPs才能有肿瘤磁热疗的效果。此外，即使一个剩余的癌细胞也可以导致肿瘤形成的复发，重复应用微热疗(41-45Γ，尽量减少对周围健康组织的继发效应)与其他治疗方法相结合的应当优先考虑。如果可以开发出允许1NPs反复加热的材料将会对治疗癌症非常有利。当注射分散体(自由)1NPs，1NPs对肿瘤细胞的吸收/粘附是一个成功治疗的关键。然而，在交变磁场中的应用，可以预见粘附在细胞上的1NPs会从死亡的肿瘤细胞和吞噬细胞中释放。
【发明内容】
[0005]发明目的:为了克服上述问题，本发明的目的是将1NPs封装在纳米纤维中最终是将它们放置在肿瘤附近的肿瘤细胞中，通过磁力加热杀死癌细胞并杀死它们。
[0006]技术方案:为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为:
通过静电纺丝过程来制备磁性纳米静电纺丝纤维，在交变磁场下，可实现给癌症细胞反复加热冷却的循环，使癌症细胞致死。
[0007]所述的应用:静电纺丝过程中的易用性和灵活性等优点允许聚合物纤维的制备可以通过任一水溶液或有机溶剂的聚合物溶液，因此静电纺丝纤维的物理尺寸具有高度的可控性。静电纺丝纤维网具有较高的比表面积和发达的孔隙率，这有益于和(癌症)细胞的结合。而且，静电纺丝纤维却可以封装大量的1NPs，静电纺丝纤维的加热效果相对较好。一旦将包含了 1NPs的纤维网放置在所需的位置，则在肿瘤周围1NPs的含量将保持稳定，从而在局部达到重复加热的效果。
[0008]—种制备磁性静电纺丝纤维的方法，包括以下步骤:
1)采用静电纺丝装置制备装载有Fe304纳米颗粒的聚苯乙烯纤维网；为使Fe304纳米粉末在THF中充分分散，我们在9mLTHF溶液中添加0.6g粉末，然后将分散系统放置在超声波中振荡24h小时。然后将聚苯乙烯溶液(DMF: THF = I: 3)添加到1NPs分散系中，随后将其电纺成纤维。通常情况下，我们使用注射栗将5mL的PS/1NPs混合溶液以2mL/h的速度进行电纺。外加电压是10kV，纺出的纤维用接地旋转收集器进行收集；
2)纤维的表面修饰；将电纺出的带磁性的PS浸入浓硫酸(9.8M，1ml)中并搅拌三分钟，使纤维表面发生磺化反应。从而使带负电荷的纤维被移除到酸溶液中，然后用蒸馏水进行冲洗直至溶液pH接近中性。磺化后的PS纤维用PAH水溶液(2mg/ml，0.5M NaCl，5ml)浸泡15min后用蒸馏水冲洗三次。最后，PAH包覆的纤维再在胶原蛋白溶液(0.45mg/ml inPBS)中浸泡15min后用蒸馏水冲洗三次；
3)卵巢癌在纤维网上的吸附；中性、带负电荷和胶原蛋白包覆的带磁性的纤维暴露于分散在细胞培养基(在离心管)上的卵巢癌细胞中，放置在37°C和5% C02的潮湿空气中振荡。两小时后，将所有的样品转移到6个培养皿中并在保温箱中储存过夜。然后所有的样品都用DAPI荧光剂(0.5 μ g/ml)在室温下进行核染色5分钟，然后用PBS溶液清洗三次；
4)磁性纤维的加热；为了观察纤维的加热能力，我们将281mg的带磁性的PS纤维(含有20%的1NPs (质量比)分散到含有ImL水的离心管中，然后将离心管放到磁场加热装置线圈的交变磁场进行加热，样品的温度用和加热装置耦合的高灵敏度的电子温度计进行测量。磁性纤维周围培养皿中的铁离子浓度用之前说过的方法进行测量。基于使用对Fe3+响应的钛试剂化合物作为指示剂染料的分光光度法。
[0009]5)少量的纤维用硅片接收并在氮气中干燥，然后用金飞溅纤维层。显微镜图像用FEI记录，在15KV的加速电压下进行扫描电镜(Quanta 200FEG)的操作。
[0010]步骤I)中，所述的装置有高压电源、注射器、平头电极针、接地收集器。
【附图说明】
[0011]图1是制备工艺及结果图，其中A是PS溶液(DMF/THF: 1/3)添加上分散的1NPs后经静电纺丝成纤维；B是静电纺丝PS纤维的扫描电子显微镜(SEM)图像，纤维平均直径为5 μπι ;图C是PS溶液加载不同浓度的1NPs电纺成的纤维，扫描电镜证实当静电纺丝纤维含有20%的1NPs并没显示出异常的形态；图D是含有282mg 1NP的PS纤维在施加交变磁场(600安培，232kHz)的情况下将I毫升23°C的水加热到83°C只需要180秒的结果图，这些结果表明了纤维的强大的加热能力；图E是含1NP的静电纺丝纤维有连续加热和冷却的这个性能的示意图。
[0012]图2是PS-1ONPs纤维暴露于连续旋转的卵巢癌细胞的代表性图片，避免细胞沉淀在顶部的纤维网各种表面的代表性图像；其中A是表示细胞粘附在非官能化PS-1ONPs纤维是相当有限的示意图是附着硫酸基团的PS-1ONPs纤维并没有提高与癌细胞的结合，可以预期细胞膜呈现净负电荷。C蓝色荧光图像显示细胞核用DAPI染色覆盖。
[0013]图3是粘附卵巢癌细胞的PS-1ONP纤维由分别用温水浴加热和磁场加热的对比图；其中，A是在37°C下水浴I小时。B是在45°C下水浴I小时；C是在37摄氏度下水浴3小时。D是在45°C下水浴3小时；E是在水浴中，暴露在加热/冷却循环中3小时，F表示，绿色:活细胞，红:死亡细胞，所有的照片都是传输图像显示纤维和双色荧光图像叠加。
[0014]图4是粘附卵巢癌细胞的PS-1ONP纤维由磁场加热结合的可行性；其中，A是PS-1ONP纤维在350Amp和232kHz交变磁场经加热的温度-时间曲线(20% 1NPs) ；B是对照样本，将细胞保持在37°C水浴中，保持I小时；C-H是在不同的时间下PS-1ONP纤维(20%1NPs)吸附卵巢癌细胞后被交变磁场加热到450C (C:lmin,D:5min，E:10min，F:20min，G:30min，H:60min)，绿色:活细胞，红:死亡细胞；所有的照片都是传输图像显示纤维和双色荧光图像叠加。
【具体实施方式】
[0015]下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。
[0016]以下实施例中所使用的主要药品为:DMF(N，N-二甲基甲酰胺)，THF(四氢呋喃)，4，5-二轻基-1，3-二苯磺酸钠盐水合物(钛试剂)，从Aldrich (Steinheim，Germany)购买的 50nm 的 Fe304 纳米粉末(< 50nm) (CAS 号:1317-6-9)，从 Sigma-Aldrich(Bornem，Belgium)购买的PAN(聚丙稀腈)，从Alfa Aesar (Karlsruhe，Germany)购买的聚苯乙稀(PS，分子量为 100 000g/mol，批号为 10099118)，以及从 Invitrogen (Merelbeke，Belgium)购买的哺乳动物细胞活性/细胞毒性试剂盒和鼠尾胶原蛋白。
[0017]实施例1
I)电纺装载有Fe304纳米颗粒的聚苯乙烯纤维网
为使Fe304纳米粉末在THF中充分分散，我们在9mLTHF溶液中添加0.6g粉末，然后将分散系统放置在超声波中振荡24h小时。然后将聚苯乙烯溶液(DMF: THF = I: 3)添加到1NPs分散系中，随后将其电纺成纤维。使用的装置有高压电源、注射器、平头电极针、接地收集器。通常情况下，我们使用注射栗将5mL的PS/1NPs混合溶液以2mL/h的速度进行电纺。外加电压是10kV，纺出的纤维用接地旋转收集器进行收集。
[0018]数据进一步表明，大多数的1NPs封装在纤维内并不存在于纤维表面所以不会导致1NPs的泄漏。值得注意的是，当PS纤维加载1NPs的含量过高时，静电纺丝成的1NP-PS纤维会呈现串珠状(由于1NP-PS分散体粘度增加)。所以在本文中，使用的是含20%的1NPs纤维。
[0019]2)纤维的表面修饰。
将电纺出的带磁性的PS浸入浓硫酸(9.8M，10ml