单克隆抗体nj001-1在制备抑制nsclc侵袭及转移的药物中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物药物领域，涉及单克隆抗体NJ001-1在制备抑制NSCLC侵袭及转 移中的应用。
【背景技术】
[0002] 肺癌的侵袭与转移是其恶性标志和特征，也是影响肺癌患者治疗效果和导致患 者死亡的最主要原因。肺癌可分为小细胞肺癌和非小细胞肺癌（Non-small-cell Lung Cancer，NSCLC)，其中NSCLC约占85%，NSCLC中又以肺腺癌最为常见。NSCLC起病隐匿，发 展迅速，预后差，不治疗者的中位生存期仅为4~5个月，1年生存率为10%左右，5年生存 率不足5%。多数NSCLC患者在临床初诊时已出现远处转移（IV期），化疗药物治疗效果很 不理想。目前，非小细胞肺癌细胞发生转移的分子机制尚未完全阐明，而临床上也缺乏特异 性高、针对性强的抑制肺癌细胞转移的治疗药物。因此，探索肺癌侵袭转移的分子机制，寻 找并开发治疗肺癌侵袭转移的有效药物与治疗途径，是肺癌分子生物学研究的关键所在。
[0003] 肿瘤的侵袭转移是一个多步骤、多阶段、多途径、涉及多基因变化的复杂过程。有 研究表明，在癌细胞侵袭和转移过程中多个信号通路可以被激活，如RAS/MAPK通路，Akt/ PI3K通路和ERK通路等，从而使细胞产生肿瘤细胞的生物特征和行为。通常情况下，肿瘤 侵袭和转移是一个主动的过程，需肿瘤细胞与肿瘤机制成分共同参与，常包括三个步骤：月中 瘤细胞与细胞外基质的黏附；肿瘤细胞释放或诱导释放多种蛋白水解酶，降解细胞外基质； 降解区域的肿瘤细胞在趋化因子的引导下转移，在此基础上肿瘤细胞于靶标组织中诱导血 管形成，对抗宿主抗肿瘤免疫，最终在远处形成转移灶。
[0004] 金属蛋白酶组织抑制因子-3 (??ΜΡ-3)是一种结合细胞外基质（ECM)的非可溶性 蛋白。??ΜΡ-3参与正常组织的发育和重建过程，也参与了许多疾病的发生。??ΜΡ-3-方面 可以刺激成纤维细胞增殖，另一方面却诱导恶性肿瘤细胞的凋亡。由于??ΜΡ-3能以I : 1 分子比例与基质金属蛋白酶（MMPs)非共价结合，抑制MMPs的活性，因此??ΜΡ-3有抑制肿 瘤生长、侵袭和转移的作用，肿瘤组织中??ΜΡ-3表达水平的下调或丢失将促进肿瘤的进 程。由此可见，基质金属蛋白酶（MMPs)及其抑制剂（??ΜΡ)是调控非小细胞肺癌侵袭转移 能力的关键因子。
[0005] 恶性肿瘤细胞从原发部位经淋巴、血液、体腔等途径播散到其他部位的过程为肿 瘤的转移。恶性肿瘤细胞的转移是其区别于正常细胞的特征之一，是其本身的生物学特 征。肿瘤的转移是其危及宿主生命及影响治疗效果的主要原因。恶性肿瘤细胞能够转移，其 原因在于它与正常细胞具有诸多方面的不同，如：生长调控机制的丧失、质膜流动性改变、 细胞运动能力的改变、细胞异型性增加、粘附性改变、细胞极性改变等。在不同的肿瘤，其细 胞特性不完全相同，因此其转移能力也不相同，即使在同一瘤体内，也可能存在具有不同转 移潜能的细胞亚群。目前抗转移药物的研究主要针对肿瘤转移的机理以及转移过程中肿瘤 细胞、机体组织的各种变化进行了多方面的研究，但由于肿瘤转移本身的多变性、复杂性， 影响因素的多样性，以及研究手段的限制，到目前为止，尚未发现确切的可以控制恶性肿瘤 转移动药物。
[0006] 目前，应用于临床的抗肿瘤药物虽然能在一定程度上抑制肿瘤生长，促进肿瘤细 胞凋亡，然而对肿瘤细胞的侵袭和转移并无显著的抑制作用。肿瘤细胞的凋亡和侵袭转移 是分子机制不同的两个病理生理过程。调控细胞凋亡的途径主要包括线粒体途径、内质网 途径和死亡受体途径。然而，肿瘤细胞侵袭转移大多与基质金属蛋白酶及其抑制物的基因 表达、上皮间质化等相关。以临床应用的铂类抗肿瘤药物-顺铂、卡铂等为例，虽然铂类药 物能显著抑制肿瘤增殖，抗癌谱较广，但其无法抑制肿瘤的侵袭和转移。因此，能够促进肿 瘤细胞凋亡、抑制肿瘤生长的药物或抗体并不一定能够用于抑制肿瘤侵袭与转移。开发针 对恶性肿瘤转移的药物将成为延长肿瘤患者生存时间、提高肿瘤治疗效果的重要途径。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供单克隆抗体NJ001-1在制备抑制 NSCLC侵袭及转移的药物中的应用。
[0008] 本发明的目的可通过以下技术方案实现：
[0009] 单克隆抗体NJ001-1在制备抑制NSCLC侵袭及转移的药物中的应用。所述的单克 隆抗体NJ001-1由保藏号为CCTCC NO :C201172的杂交瘤细胞株NM001-1分泌。
[0010] 单克隆抗体NJ001-1在抑制NSCLC侵袭及转移中所作用的关键基因作为靶点在制 备抑制NSCLC侵袭及转移的药物中的应用。
[0011] 所述的单克隆抗体NJ001-1在抑制NSCLC侵袭及转移中所作用的关键基因优选编 码转录因子FOXPl。
[0012] 本发明所述的单克隆抗体NM001-1的制备方法见CN102391992B。
[0013] 有益效果：
[0014] 单克隆抗体NJ001-1能够特异性识别位于NSCLC细胞浆与细胞膜上的SP70抗 原，具有诱导NSCLC细胞凋亡的作用，且对肿瘤细胞的侵袭和转移也存在潜在性影响。单 克隆抗体NJ001-1能有效抑制肺腺癌细胞的迀移（图1)和侵袭（图2)，并能显著增加 HMP-3mRNA和蛋白表达（图3)。单抗NJ001-1作用下，肺腺癌细胞核内NJ001-1特异性抗 原能与转录因子FOXPl结合，抑制其对TIMP-3基因启动子区的转录抑制作用。
【附图说明】
[0015] 图1细胞划痕实验检测肺腺癌细胞迀移能力
[0016] A :单抗NJ001-1处理SPC-Al细胞Oh和48h "划痕"图；
[0017] B :单抗组与对照组SPC-Al细胞迀移距离比较；
[0018] *单抗组和相应对照组间比较，*Ρ〈0· 05, #Ρ〈0· 01，*#Ρ〈0· 001。
[0019] 图2 Transwell实验检测肺腺癌细胞侵袭能力
[0020] 图3单抗NJ001-1诱导??ΜΡ-3表达
[0021] 图4单抗NJ001-1特异性抗原（50kDa)与FOXPl相互作用
[0022] 生物材料样品的保藏信息
[0023] 杂交瘤细胞株NM001-1于2011年8月31日保藏于中国典型培养物保藏中心，保 藏地址为中国武汉，武汉大学，保藏号为CCTCC NO :C201172。
【具体实施方式】
[0024] 实施例1
[0025] 1、细胞迀移检测
[0026] 收集处于对数生长期的肺腺癌细胞SPC-A-I制成单细胞悬液，以2X IO5细胞/孔 加入6孔细胞培养板中，过夜培养，吸弃培养上清，并用Hank's液500 μ 1/孔洗一遍。抗体 组（50 μ g/mL、100 μ g/mL和150 μ g/mL三组）：每孔加入单抗NJ001-1溶液，终浓度分别为 50 μ g/mL、100 μ g/mL和150 μ g/mL每孔；对照组（0 μ g/mL):每孔加入20ml培养液。干预 后培养24h和48h，用于细胞迀移检测。每组设3个平行孔，实验重复3次。
[0027] 2、细胞迀移能力（划痕实验）检测
[0028] 原理：当细胞长到融合成单层状态是，在融合的单层细胞上人为制造一个空白区 ±或，称为"划痕"（Wound)。划痕边缘的细胞会逐渐进入空白区域使"划痕"愈合（Healing)。 基本的步骤包括"划痕"的制造，细胞迀移期间图像的获得以及后期数据的处理。
[0029] 操作过程：
[0030] (1)将2X IO5细胞/孔加入6孔细胞培养板中，过夜培养，待细胞长到融合状态。 数量以贴壁后铺满板底为宜；
[0031] (2)用消毒后的10 μ 1进口枪头在洗净的细胞表面划出四道相互垂直的"井"字划 痕；
[0032] (3)吸去细胞培养液，使用PBS缓冲液洗涤细胞3次，洗去划痕产生的细胞碎片；
[0033] (4)选择划痕视野，进行标记，并于显微镜下进行观察拍照；
[0034] (5)将6孔细胞培养板放入细胞培养箱培养，分别于24h和48h后取出拍照；
[0035] (6)划痕愈合情况以细胞伤口愈合间距与细胞划痕的间距比例进行计算。
[0036] 结果：
[0037] 50 μ g/mL、100 μ g/mL 和 150 μ g/mL 浓度的单抗 NJ001-1 作用于肺腺癌 SPC-A-I 细 胞48h后，"划痕"愈合能力降低，即与对照组（未经单抗NJ001-1处理）相比，单抗组划痕 空白处的距离较宽。通过测量单抗组和对照组Oh和48h的"划痕"宽度，计算SPC-A-I细胞 迀移距离，比较各组SPC-A-I细胞迀移能力的差异。结果显示，单抗组SPC-A-I细胞迀移能 力受到不同程度的抑制，其中100 μ g/mL和150 μ g/mL单抗NJ001-1作用于SPC-Al后细胞 迀移能力降低，与对照组相比具有统计学差异（P值均小于〇. 05) ;50 μ g/mL单抗NJ001-1 作用于SPC-Al后细胞迀移距离变小，但与对照组相比无统计学差异。上述结果表明，单抗 NJ001-1能抑制肺腺癌细胞迀移。低剂量单抗NJ001-1对肺腺癌细胞迀移能力的抑制作 用并不明显，但随着单抗NJ001-1浓度的增加，肺腺癌细胞的迀移能力逐渐降低，提示单抗 NJ001-1能剂量依赖性的对肺腺癌细胞迀移发挥抑制作用。
[0038] 实施例2
[0039] (1)细胞侵袭检测
[0040] 收集处于对数生长期的SPC-A-I和A549制成单细胞悬液，以8 X IO4细胞/孔加 入24孔细胞培养板中。抗体组（50 μ g/mL、100 μ g/mL和150 μ g/mL三组）：每孔外室加入 单抗NJ001-1溶液，终浓度分别为50 μ g/mL、100 μ g/mL和150 μ g/mL每孔；对照组（0 μ g/ mL):每孔加入500 μ 1培养液。干预后培养24h，用于细胞侵袭检测。每组设3个平行孔， 实验重复3次。
[0041] ⑵细胞侵袭能力（Transwell实验）检测
[0042] 原理：将transwell小室放入培养板中，小室内称为上室，培养板内称为下室，上 室内添加上层培养液，下室内添加下层培养液，上下层培养液以膜相隔。将细胞种在上室 内，由于膜有通透性，下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞，从而可以研究下层培 养液中的成分对细胞生长、运动等的影响。选择不同材料的膜和孔径，可以进行共培养、细 胞趋化、细胞迀移、细胞侵袭等多种方面的研究。
[0043] 操作过程：
[0044] (1)在Transwell 24孔细胞培养板的小室中加入60 μ 1基质胶（ECM gel)稀释 液，基质胶与无血清RPMI-1640培养液的稀释比例为1:9 ;
[0045] (2)将Transwell 24孔细胞培养板放入37 °C细胞培养箱，使基质胶自然凝固；
[0046] (3)将肺腺癌细胞重悬于无血清RPMI-1640培养液，每小室加入I X IO5~I X 10 6细胞（具体因细胞穿透能力不同而改变），上室内无血清RPMI-1640培养液总体积为 200 μ 1 ；
[0047] (4)根据细胞分组，在下室内加入500 μ 1含10% FBS的RPMI-1640培养液，其中 单抗 NJ001-1 的浓度分别为 0