μ g/mL、50 μ g/mL、100 μ g/mL 和 150 μ g/mL ;
[0048] (5)将Transwell 24孔细胞培养板放入细胞培养箱培养，于24h后取出；
[0049] (6)用棉签将transwell小室内表面的细胞擦去，95%乙醇固定小室外表面细胞 20min ；
[0050] (7)用1 %结晶紫染料对小室外表面细胞进行染色，20min ;
[0051 ] (8)预冷的PBS缓冲液清洗小室外表面细胞3次，从小室内表面吸去残留液体；
[0052] (9)奥林巴斯光学显微镜下观察穿透基质胶的细胞，并拍照计数。
[0053] 结果：
[0054] 50 μ g/mL、100 μ g/mL和150 μ g/mL浓度的单抗NJ001-1作用于肺腺癌细胞 (SPC-A1和A549)24h后，发生侵袭的肺腺癌细胞数量明显减少，与对照组（未经单抗 NJ001-1处理）相比具有统计学差异（P值均小于0.05);随着单抗NJ001-1浓度的增加，具 有侵袭能力的肺腺癌细胞数量显著减少。上述结果表明，单抗NJ001-1能显著抑制肺腺癌 细胞的侵袭能力，并且这种抑制作用具有明显的剂量依赖性。
[0055] 实施例3??ΜΡ-3表达检测
[0056] RT-PCR ：
[0057] 1)样本准备
[0058] 弃去培养板中培养液，每孔加入700 μ I Trizol试剂，用Trizol分别反复吹打细 胞，进行消化、裂解。待细胞完全溶解后收集溶液于去酶EP管中，_70°C保存。
[0059] 2) RNA 提取
[0060] (1)调节台式冷冻高速离心机至4°C ;
[0061] (2)从-70°C冰箱取出已加 Trizol的细胞团；
[0062] (3)待细胞团溶解后用枪头轻轻吹打或漩涡震荡混匀，漩涡震荡Imin ;
[0063] (4)室温（15 ~25°C )放置 5min ;
[0064] (5)加140 μ 1氯仿，轻轻盖紧管盖，剧烈震荡15s ;
[0065] (6)室温静置2~3min ;
[0066] (7)4°C 12000gX15min，将离心机调至常温；
[0067] (8)将上层水相小心吸置一新的EP管（提供），加 L 5倍体积（约525 μ 1)的无 水乙醇，用枪头轻轻吹打混匀，立即进行下步操作；
[0068] (9)吸700 μ1至柱内，轻盖管盖，常温（15°C~25°C)，兰10000rpmX15sec弃液， 若液体总体积大于700 μ 1则重复步骤（9);
[0069] (10)加700 μ I Buffer RWT至柱子膜上，轻轻盖好盖子，常温（15 °C~25°C )， 兰 1000 OrpmX 15sec 弃液；
[0070] (11)加500 μ I Buffer RPE至柱子膜上，轻轻盖好盖子，常温（15 °C~25°C )， 兰 1000 OrpmX 15sec 弃液；
[0071] (12)加500 μ1 Buffer RPE至柱子膜上，轻轻盖好盖子，常温（15°C~25°C )， 兰 1000 OrpmX 2min 弃液；
[0072] (13)小心移出柱子至新的2ml EP管，高速离心Imin ;
[0073] (14)将柱子移至新的I. 5ml EP管，吸取30~50 μ I ddH20至柱子膜上，轻轻盖好 管盖，=1000 OrpmX Imin ；
[0074] (15)如果浓度兰30 μ g，重复步骤（15)。
[0075] 3) cDNA 合成（使用日本 TAKAR 公司 PrimeScript? RT Master Mix (Perfect Real Time)反转录试剂盒）
[0076] (I)逆转录反应体系：
[0078] (2)在PCR扩增仪进行逆转录反应：16°C 30min，42°C 30min，85°C 5min ;反应结束 后将其放在冰上待用或-70 °C保存。
[0079] 4) PCR 检测
[0080] (1)反应体系（10 μ 1): CN 105126098 A 说明书 6/8 页
[0082] 引物序列：??ΜΡ-3 上游引物：5 ' -CCTGCTGACAGGTCGCGTCT-3 ';下游引物： 5 ' -TCCAGAGACACTCGTTCTTG-3，。MMP-7 上游引物：5，-TCGAGACTTACCGCATATTAC-3 ' ； 下游引物：5 ^ -TCCAGCGTTCATCCTCAT-3 ^ ; β -actin作为内参基因，上游引物： 5 ' -TGGCCCCAGCACAATGAA-3';下游引物：5' -CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA-3'。
[0083] (2)在 PCR 扩增仪进行扩增反应：95°C IOmin 1 个循环，95°C 15sec，60°C lmin，45 个循环；反应结束后根据所得CT值应用2 ΛΛ CT法计算miRNA的相对表达量。
[0084] Western Blot方法检测蛋白表达
[0085] (1)准备制胶板
[0086] 用洗衣粉液轻轻擦洗玻璃板，用自来水冲洗干净后再用蒸馏水冲洗，晾干后将厚 薄两侧玻璃板底部对齐，压力均衡，安装于制胶架；
[0087] (2)按下表配制分离胶和浓缩胶
[0089] 配胶时，按表顺序加试剂，TEMED加入混匀后立即沿一侧缓慢注入玻璃板夹层。 分离胶灌制量为4ml/块，留浓缩胶所需高度（比梳齿长度长Icm)，加蒸馏水压平，静置 60min (室温较低时延长时间）聚合。倾倒玻璃板去除蒸馏水，滤纸吸干，不能触及凝胶。按 上表配制浓缩胶并灌注，与外层的薄玻璃平齐，从一侧倾斜插入梳子，防止气泡产生，静置 30min使其聚合，保鲜膜上加适量CldH2O包裹凝胶后放4°C冰箱过夜；
[0090] 将玻璃板移入电泳槽，内槽加满电泳缓冲液，观察是否漏液，并且除去黏附于凝胶 底部的气泡，否则影响电流畅通，拔去梳子，避免点样孔撕裂；
[0091] (3)样品处理与上样
[0092] 蛋白样品中加入等量的2X电泳样品缓冲液，混匀后煮沸5min，4°C，12 OOOrpm离 心5min，取样品加入点样孔，各孔蛋白量均等。同时加分子量标准蛋白质Marker为对照；
[0093] (4)电泳
[0094] 60V电压下电泳至样品全部离开点样孔至分离胶界面时改电压为80V，继续电泳 适当时间后断电停止电泳；
[0095] (5)转膜
[0096] SDS-PAGE快结束时做好转膜的准备工作（准备冰和冰盒，转膜缓冲液预冷，PVDF 膜，将海绵和滤纸放入转膜缓冲液中浸泡）
[0097] I
[0098] 轻轻撬开玻璃板，根据Marker判断目的片段的位置，切下胶，浸入转膜缓冲液
[0099] I
[0100] 根据胶的大小剪相应大小的PVDF膜，膜略大，不能小并剪角做好标记
[0101] I
[0102] PVDF膜用甲醇活化lmin，然后用转膜缓冲液漂洗Imin
[0103] I
[0104] 按黑胶白膜的顺序装好膜和胶的夹层，按胶负极膜正极的顺序装好电泳转移槽
[0105] I
[0106] 电泳转移槽放于冰中，槽内放冰袋加入预冷的转膜缓冲液，恒流状态下IOOmA转 膜，转膜电流和时间可根据分子量大小调节
[0107] I
[0108] 转膜结束后小心取下膜，5%脱脂奶粉（TBST配制）室温封闭3h
[0109] I
[0110] 加一抗反应（抗体按相应说明稀释），4°c过夜。
[mu] I
[0112] I X TBST洗膜，15min更换一次洗膜缓冲液，共3次
[0113] I
[0114] 加二抗，室温反应lh，期间于摇床上缓慢摇动
[0115] I
[0116] I X TBST洗膜，15min更换一次洗膜缓冲液，共3次
[0117] I
[0118] 用滤纸吸干膜缓冲液后，将膜放于封口膜上
[0119] I
[0120] 加 ECL发光AB混合液体，反应3min，操作过程中注意避光
[0121] I
[0122] 放入暗盒中在暗室进行曝光，曝光时间从IOs到Ih不等
[0123] I
[0124] 显影，注意把握显影时间，漂洗，定影至胶片透明
[0125] I
[0126] 利用凝胶成像系统采集图像并保存
[0127] 结果：
[0128] 50 μ g/mL、100 μ g/mL和150 μ g/mL浓度的单抗NJ001-1作用于肺腺癌细胞 (3卩(：41和4549)2411后，能显著增加1'頂?-31111?熟和蛋白表达，与对照组（未经单抗町001-1 处理）相比具有统计学差异（P值均小于0. 05)。
[0129] 实施例4单抗NJ001-1特异性抗原与核转录因子FOXPl的相互作用
[0130] 免疫共沉淀：
[0131] 单抗NJ001-1处理SPC-Al后，用总量Img的SCP-Al细胞核蛋白和POXPl抗体 (3 μ g)或兔IgG和protein A-Agarose孵育。FOXPl复合物用SDS缓冲液洗脱，获得蛋白 进行Western Blot检测。
[0132] 结果：
[0133] 单抗NJ001-1作用下，肺腺癌细胞核内单抗NJ001-1特异性抗原能与转录因子 FOXPl结合，抑制其对TIMP-3基因启动子区的转录抑制作用（图4)。
【主权项】
1. 单克隆抗体NJOOl在制备抑制NSCLC侵袭及转移的药物中的应用；其中，所述的单 克隆抗体NJ001由保藏号为CCTCC NO :C201172的杂交瘤细胞株NM001-1分泌。2. 单克隆抗体NJ001在抑制NSCLC侵袭及转移中所作用的关键基因作为靶点在制备抑 制NSCLC侵袭及转移的药物中的应用。3. 根据权利要求2所述的应用，其特征在于所述的单克隆抗体NJ001在抑制NSCLC侵 袭及转移中所作用的关键基因为编码转录因子F0XP1。
【专利摘要】本发明公开了单克隆抗体NJ001-1在制备抑制NSCLC侵袭及转移的药物中的应用。单克隆抗体NJ001-1在制备抑制NSCLC侵袭及转移的药物中的应用。所述的单克隆抗体NJ001-1由保藏号为CCTCC？NO：C201172的杂交瘤细胞株NM001-1分泌。单克隆抗体NJ001-1能有效抑制肺腺癌细胞的迁移和侵袭，并能显著增加TIMP-3mRNA和蛋白表达。单抗NJ001-1作用下，肺腺癌细胞核内单抗NJ001-1特异性抗原能与转录因子FOXP1结合，抑制其对TIMP-3基因启动子区的转录抑制作用。CCTCC NO：C20117220110831
【IPC分类】A61P35/00, A61K39/395
【公开号】CN105126098
【申请号】CN201510465819
【发明人】潘世扬, 徐建, 王芳, 黄珮珺
【申请人】南京壬辰生物科技有限公司
【公开日】2015年12月9日
【申请日】2015年7月31日