)中并搅拌三分钟，使纤维表面发生磺化反应。从而使带负电荷的纤维被移除到酸溶液中，然后用蒸馏水进行冲洗直至溶液PH接近中性。磺化后的PS纤维用PAH水溶液(2mg/ml，0.5M NaCl, 5ml)浸泡15min后用蒸馏水冲洗三次。最后，PAH包覆的纤维再在胶原蛋白溶液(0.45mg/ml in PBS)中浸泡15min后用蒸馏水冲洗三次。
[0020]3)测试制成的PS-1ONPs纤维网的加热能力，研究施加交变磁场的性能。
为了观察纤维的加热能力，我们将281mg的带磁性的PS纤维(含有20%的1NPs (质量比)分散到含有ImL水的离心管中，然后将离心管放到磁场加热装置线圈的交变磁场进行加热，样品的温度用和加热装置耦合的高灵敏度的电子温度计进行测量。磁性纤维周围培养皿中的铁离子浓度用之前说过的方法进行测量。基于使用对Fe3+响应的钛试剂化合物作为指示剂染料的分光光度法。
[0021]图1D显示含有282mg 1NP的PS纤维在施加交变磁场(600安培，232kHz)的情况下将I毫升23°C的水加热到83°C只需要180秒。这些结果表明了纤维的强大的加热能力。随后计算了 PS-1ONPs纤维的特定吸附率(SAR)。在700kHz和22.lkA/m的交变磁场下，每克PS-1ONPs纤维的SAR为84W，而每克1NPs的SAR值(相类似的直径)为64.6-165W范围之间。一般情况下，1NPs的磁场感应加热通过布朗运动，奈尔松弛或磁滞现象的结合而产生的。由于1NPs是强疏水性的，所以1NPs在水环境中会聚集在一起，这给1NPs加热的精确机理的研究造成了很大的困难。但1NPs是被牢牢地封装在静电PS纤维中，所以它们的布朗运动是非常有限的，而体积相对比较大的1NPs (直径50纳米)的磁滞现象相对于奈尔松弛更加明显，成为磁场能量耗散的主要机理。正如之前所提到的，将1NPs加载在纤维网上将其应用在体内的一个主要优势就是他在局部位置能够提供反复电磁加热的能力。图1E表明含1NP的静电纺丝纤维绝对有连续加热和冷却的这个性能，纤维网会一直保持良好的供热性能(从曲线在加热阶段的斜率可以看出)。此外，在周围介质中没有检测到铁(数据未显示)表明纤维保持完整，在不释放任加载的1NPs的情况下即可反复加热。
[0022]将静电纺丝纤维封装上1NPs的另外一个附加优点就是这样的纤维有非常高的比表面积；这会提高它们与周围细胞的相互作用并且这也解释了为什么将这种纤维应用在组织工程中会有这么多的关注。此外，对纤维表面化学修饰提供了进一步的机会。在这项研究中，静电纺纤维磁感应的目的是杀死癌细胞。为了达到这个目的，一个重要的要求就是纤维对癌细胞的粘附。图2是PS-1ONPs纤维暴露于连续旋转的卵巢癌细胞的代表性图片。避免细胞沉淀在顶部的纤维网各种表面的代表性图像。图2A显示出细胞粘附在非官能化PS-1ONPs纤维是相当有限的。附着硫酸基团的PS-1ONPs纤维并没有提高与癌细胞的结合(图2B)，可以预期细胞膜呈现净负电荷。然而，当硫酸化的PS-1ONPs纤维涂上聚(丙烯胺盐酸盐)(PAH，这是一种弱阳离子聚电解质)，并在纤维表面上进一步附上细胞外基质的重要组成部分并且可促进多种类型细胞粘结的胶原蛋白，这使得纤维粘附的细胞得到显著的提尚。
[0023]4)分析加热的纤维对粘附在纤维上的卵巢癌细胞的影响。
样品分别用温水浴加热(图3，对照实验)和磁场加热(图4)。加热后，用钙黄绿素对细胞进行染色(a)，而部分的黄绿素会被活细胞内的溶酶酯清除掉(所以当细胞是活的时候细胞质会产生绿色的荧光)。用乙锭均二聚物染色(b)，细胞膜不会透过这种红色染料，所以受损的细胞周围会染上红色。图3A显示出附着在纤维上的细胞在37°C培养一个小时的条件下对存活率没有影响，通过附着在纤维上的绿色荧光细胞可证明这一点儿。当细胞在45°C条件下培养一小时，明显的观察到绿色荧光的细胞质减少并且大量的细胞呈现出红色的细胞核，这表明细胞大量死亡(图3B ;22%细胞死亡)。当细胞在37°C条件下培养3小时也不影响细胞的存活率(图3C ;9%细胞死亡)，而当细胞在45°C条件下培养3小时细胞的死亡率比I小时升高(图3D ;61%细胞死亡)。对细胞反复的加热和冷却会造成更多的细胞被破坏，细胞在加热(45°C )和冷却(37°C )5个循环的条件下的温度-时间曲线如图3所示。在图3E中的数据显示出，在循环加热和冷却的条件下，造成细胞全部死亡，这相比于细胞在45°C时连续加热三小时的死亡率得到显著提高(图3D)。
[0024]将SK0V-3细胞加载上PS-1ONP纤维通过交变磁场远程加热。应用交变磁场使得在纤维网的周围介质能够快速连续的升高温度(见图1)，不断调整磁场的频率和幅度使温度迅速达到45°C并在实验过程中保持此温度。图4A显示磁性纤维网周围介质具有代表性的温度-时间曲线:施加的交变磁场时，在大约两到三分钟温度迅速增加到45°C并稳定保持在45°C (在大多数的观察下开始时的最大超量2°C)。图4B显示出那些“可控”的细胞放在水浴37°C—小时时并没有表现出任何明显的细胞死亡现象，这与图3A相符合。将细胞加载在PS-1ONP纤维上暴露于磁场下I分钟会导致一些细胞死亡(图4C ;14%的细胞死亡)。当磁场施加5分钟时，细胞死亡现象变得更加明显(图4D ;24%细胞死亡)。当纤维网在磁场中暴露10分钟(图4E ;100%细胞死亡)或更长时间下癌细胞全部死亡(20分钟:4F ；30分钟:4G ；60分钟:4H ;100%细胞死亡)，正如图像所显示的绿色荧光的减少以及红色细胞核的增加。这些图像清楚地表明癌细胞与胶原蛋白覆盖的纤维的联系如所有的荧光染在纤维上定位。
[0025]5)细胞培养。
SK0V-3细胞是在(含有10 %胎牛血清、2毫摩尔的左旋谷酰胺、100 μ g/ml链霉素、100U/ml 的青霉素的，均来自于 Gibco-1nvitrogen，Merelbeke，Belgium) IMDM 培养基中培养的。
[0026]6)卵巢癌在纤维网上的吸附。
中性、带负电荷和胶原蛋白包覆的带磁性的纤维暴露于分散在细胞培养基(在离心管)上的卵巢癌细胞中，放置在37°C和5% C02的潮湿空气中振荡。两小时后，将所有的样品转移到6个培养皿中并在保温箱中储存过夜。然后所有的样品都用DAPI荧光剂(0.5 μ g/ml)在室温下进行核染色5分钟，然后用PBS溶液清洗三次。
[0027]7)肿瘤细胞的生存能力测定。
在分别经过水浴加热和交变磁场加热之后，对在附在磁性纤维上的癌症细胞的活性进行测定。将负载有卵巢癌细胞的磁性纤维放在含有ImL完整细胞培养基的离心管中，然后分别在37°C和45°C的水浴温度下加热Ih和3h，为了研究多次加热的影响，我们将一个样品进行5次加热和冷却的循环，持续时间为3小时(时间温度关系见图3)。
【主权项】
1.PS静电纺丝纤维加载磁性氧化物纳米粒子(1NPs)可以给癌症细胞加热，杀死癌症细胞。2.根据权利要求1所述的PS-1ONPs静电纺丝纤维的应用，其特征在于:加载的氧化铁纳米颗粒(1NPs)的含量可以受到很好地控制，并且PS-1ONPs纤维可以通过MRI在体内得到定位。此外，磁性纤维可以反复使用而不降低它的加热能力以及磁性氧化铁纳米颗粒的释放含量。磁性静电纺丝纤维可以在体内给癌症组织细胞高效反复加热。3.一种制备权利要求1所述的静电纺丝纤维的方法，其特征在于，包括以下步骤: 1)制备装载有Fe304纳米颗粒的PS纤维网的电纺；将聚苯乙烯溶液(DMF: THF =I: 3)添加到1NPs分散系中，随后将其电纺成纤维。使用注射栗将5mL的PS/1NPs混合溶液以2mL/h的速度进行电纺。外加电压是1kV ； 2)纤维的表面修饰；将电纺出的带磁性的PS浸入浓硫酸(9.8M，1ml)中并搅拌三分钟，使纤维表面发生磺化反应。从而使带负电荷的纤维被移除到酸溶液中，然后用蒸馏水进行冲洗直至溶液pH接近中性。磺化后的PS纤维用PAH水溶液(2mg/ml，0.5M NaCl，5ml)浸泡15min后用蒸馏水冲洗三次。最后，PAH包覆的纤维再在胶原蛋白溶液(0.45mg/ml inPBS)中浸泡15min后用蒸馏水冲洗三次。4.根据权利要求1所述的制备磁性静电纺丝纤维的方法，其特征在于:步骤I)中，所述的静电纺丝装置包括高压电源、注射器、平头电极针、接地收集器。所述的接受装置为接地旋转收集器。
【专利摘要】本发明公开了用磁性静电纺丝纤维给癌症细胞反复加热的方法。通过静电纺丝纳米纤维网可以加载50nm的磁性氧化铁纳米颗粒(IONPs)。静电纺丝的高加载能力可以给环境施加一个交变磁场，加热能力显著提高。此外，磁性纤维可以反复使用而不降低它的加热能力或者磁性氧化铁纳米颗粒的释放含量。由于用胶原蛋白对纤维表面的功能化改性而使得卵巢癌症细胞可以很好地粘附在纤维上。仅在几分钟内，通过纤维网磁场区域的调节温度就可以杀死纤维粘附的癌症细胞。这种方法比使用热水浴加热杀死细胞更有效。这个纤维网的作用(a)加载的氧化铁纳米颗粒的含量可以很好地受到控制；(b)可以通过MRI在体内得到定位。
【IPC分类】D01D5/00, A61K47/48, A61P35/00, A61K41/00
【公开号】CN105126104
【申请号】CN201510656989
【发明人】朱苗苗, 陈鄞琛, 徐海军, 姚建峰, 刘中车, 黄超伯
【申请人】南京林业大学
【公开日】2015年12月9日
【申请日】2015年10月10日