一种竹红菌乙素纳米粒及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种竹红菌乙素纳米粒及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 光动力治疗（Photodynamic therapy，F1DT)是一种具有较好应用前景的治疗方法。 其指由敏化光源辐照光敏剂引起光敏化学反应产生活性氧，从而破坏病变组织的一种治疗 方法。光敏剂自身可以选择性聚集在病变组织，治疗时可以将辐照光源局限于病变部位，实 现双重选择。PDT的优点是对病变组织有选择性杀伤，毒性低，可重复应用，也可与手术等治 疗联合应用。将PDT应用于肿瘤的治疗也是现在的热点。
[0003] 光敏剂是光动力治疗的重要组成部分。竹红菌乙素是我国首先提炼的第二代光敏 剂，是一种天然提取物质，在相应波长的光激发下，吸收能量从基态升迀到极不稳定的激发 态，激发态的光敏剂与相邻物质发生电子或氢原子转移形成的氧化还原反应，产生自由基 或自由基离子；或者三价态光敏剂将能量传递给分子态氧，产生单态氧。此类细胞毒性物质 可以作为治疗的基础。但竹红菌乙素在光疗窗口吸收低，在水中溶解度很低，当其被注入人 体内后，容易在血液中自发聚集，引发毛细管栓塞，限制了其在临床上的应用。
[0004] 为改善竹红菌乙素的溶解性，主要有两种方式，一是化学修饰，二是物理包裹；其 中，目前化学修饰还不能够使竹红菌乙素在光动力活性不降低、毒性不增强的情况下，增加 其在血液中的有效运输。物理包裹是另一种能有效改善竹红菌乙素溶解性的方式。
[0005] 纳米技术是在20世纪80年代末、90年代初兴起的边缘学科，已经广泛的应用于材 料制作、生物及医学等多个领域。在药剂学方面，纳米载药系统的出现，为靶向抗肿瘤药物 的研制提供了新的途径。应用纳米载体包裹药物，可以增加难溶性药物的溶解度，加强水溶 性药物的稳定性，提高药物的生物利用度。
[0006] 光敏剂被包封入纳米载体系统后，其在体内的生物学分布将发生改变，与纳米载 体的生物学分布密切相关。纳米粒进入血液循环后，大部分与血液中的蛋白调理素相结合， 被网状内皮系统（RES)所识别，最先被肝、脾等器官摄取，其在血液中浓度下降；仅有少部 分光敏剂经血循环到达靶向的肿瘤组织。肿瘤组织血管生长较快，其通透性也较正常血管 高，同时肿瘤组织缺乏有效的淋巴引流，因此纳米粒在肿瘤组织中具有较好的渗透性和滞 留性效应（EPR效应），从而达到对肿瘤组织的被动靶向。纳米粒在血液中药代动力学主 要受载体本身的性质如粒径、电荷、表面的化学修饰及纳米的结构与组成等方面的调控；此 外，载体的结构与组成、形状等都对其在体内的药代动力学产生一定的影响。为了避免血浆 调理作用及其他内脏系统的摄取，一个理想的纳米载体应该保持粒径在IOOnm左右，电位 在IOmV以内，并且在表面进行一定的化学修饰，进一步筛选肿瘤特异性或高表达的受体、 抗原，将相应的配体或单克隆抗体与纳米载体相耦连，依靠靶向分子特异地识别肿瘤组织， 提高对肿瘤组织的选择性，减少在周围正常组织中的聚集，将实现对药物的主动靶向传递 作用，使纳米光敏剂尽多的在肿瘤组织中蓄积。
[0007] 目前常用的靶向分子主要是特异性或高表达的单克隆抗体以及受体配基。但是 多数抗体仅结合在细胞膜上，无法实现药物的细胞内传递，同时容易引起体内的免疫反应， 使得体内应用受到很大的限制。受体配基修饰的纳米载体，由于配基与受体之间的特异性 强、高亲和力相互作用，且不易引起免疫反应，引起人们广泛关注，如叶酸，提高了对肿瘤组 织的识别能力，增加药物在靶器官的浓度，同时减少对周围组织的副作用。高亲和性的叶酸 受体可转运叶酸耦连的大分子物质，在正常细胞通过此途径一般不能摄取叶酸，而在肿瘤 细胞中叶酸受体大量表达，叶酸作为靶向分子，对叶酸受体有高亲和性，对肿瘤组织有特异 性靶向性，且本身为小分子物质，水溶性好，能在各种溶液中稳定存在，无免疫原性（较抗 体），是一个理想的靶向分子。
[0008] 纳米载体可以改变疏水性光敏剂的水溶性，更好的符合静脉给药的方式，提高生 物利用度。此外，叶酸靶向纳米载体可以通过被动及主动靶向作用提高肿瘤组织的富集能 力，增加肿瘤组织的光敏剂含量。而纳米载体的缓释作用也会保持组织的药物量。此种纳 米粒与光动力治疗联合可以更好的体现肿瘤选择性治疗，提高治疗效果。
[0009] 中国专利"水溶性竹红菌素二氧化钛纳米粒的制备方法"，开发出了一种基于二氧 化钛的竹红菌素纳米颗粒，提高了稳定性和单线态氧产率，但专利中使用的二氧化钛在静 脉注射到人体后难以被人体完全代谢清除，存在一定的安全隐患。
[0010] 中国专利"一种水溶性竹红菌素 PLGA纳米粒及其制备方法"，是以聚乳酸-羟基乙 酸共聚物作为载体材料，采用乳化冻干法制备成水溶性竹红菌素 PLGA纳米粒。但该专利制 备的纳米粒在体内以被动靶向为主，难以实现对药物的主动靶向传递。
【发明内容】
[0011] 针对上述现有技术的不足，本发明的目的是提供一种竹红菌乙素纳米粒及其制备 方法。
[0012] 为实现上述目的，本发明采用下述技术方案：
[0013] -种竹红菌乙素纳米粒的制备方法，步骤如下：
[0014] (1)将载体聚合物用有机溶剂溶解，制成浓度为10-20mg/ml的溶液A ;
[0015] (2)将竹红菌乙素用有机溶剂溶解，制成浓度为l_2mg/ml的溶液B ;
[0016] (3)将溶液A和溶液B按体积比为（1-14) : 1混合均勾，制成浓度均一的药物聚合 物有机溶液；
[0017] (4)在搅拌条件下将步骤（3)制备的药物聚合物有机溶液滴加到水中，药物聚合 物有机溶液与水的体积比为1: (10-30)，静置12-24h，制得胶束溶液；
[0018] (5)将胶束溶液转移至透析袋中，将透析袋置于水中进行透析，将有机溶液透析出 来，即得竹红菌乙素纳米粒。
[0019] 步骤（1)中，所述载体聚合物为聚乙二醇-聚乳酸（PEG-PLA)或聚乙二醇-聚乳酸 (PEG-PLA)和叶酸-聚乙二醇-聚乳酸（folate-PEG-PLA)的混合聚合物；混合聚合物中， 叶酸-聚乙二醇-聚乳酸的质量百分数为8-12%，优选为10%。将不同叶酸含量的纳米粒 与细胞孵育后，用荧光显微镜观察，可见小于8%时，含量是增加的，而大于12%时，叶酸浓 度增加并不能增加细胞内荧光的强度，叶酸受体饱和而不能相应集合更多的纳米粒，因此， 综合载体聚合物的靶向效果和实际生产成本，将混合聚合物中叶酸-聚乙二醇-聚乳酸的 质量百分数限定为8-12%。
[0020] 聚乙二醇-聚乳酸的分子量为15000-20000,聚合物中乙二醇：乳酸单体的摩尔比 例为（4-5) :1。聚合物的分子量，以及聚合物中疏水部分与亲水部分的比例关系，会直接影 响到聚合物的胶束形态，本发明通过对聚合物分子量以及聚合物中乙二醇和乳酸单体比例 的优化，制备的药物聚合物的胶束形态规则，分散状态佳。
[0021] 步骤（1)和步骤（2)中，所述有机溶剂为丙酮或四氢呋喃。本发明通过对多种不 同的有机溶剂进行考察，结果发现，应用丙酮及四氢呋喃两种有机溶剂制备的纳米胶束形 态均一，分散性也好，粒径在IOOnm左右，较其他两种有机溶剂获得的胶束粒径大，因此本 发明选用丙酮或四氢呋喃这两种有机溶剂制备纳米胶束溶液。
[0022] 步骤（4)中，搅拌采用磁力搅拌，搅拌速度为300-1200rpm/min ;优选为660rpm/ min。搅拌可改变溶液中各成分浓度的分布，有利于各种成分的分散，搅拌速率比较低溶液 中成分不均匀，纳米粒成形不好，搅拌速率增加，溶液中的成分相对均匀，保持其他条件不 变的情况下，粒径会变小且粒径比较均匀，但转速太大，反而会破坏纳米粒的形成。
[0023] 步骤（4)中，药物聚合物有机溶液的滴加速度为20-30滴/分钟。药物聚合物有 机溶液的滴加速度对胶束的形成也会产生影响，滴加速度过快，则形成的胶束的粒径大，粒 度分布宽，稳定性差；滴加速度过慢，虽然形成的胶束的粒度分布均匀，稳定性好，但滴加时 间太长，使生产周期加长。因此，掌握好药物聚合物有机溶液的滴加速度对保证制备胶束的 工艺稳定性和产品性能有重要影响。
[0024] 进一步的，步骤（4)中，药物聚合物有机溶液滴加完成后继续搅拌2_3h，防治胶束 粘连。
[0025] 步骤（4)中，在4°C条件下静置12-24h。
[0026] 步骤（5)中，透析袋的截留分子量为3500KDa。
[0027] 采用上述方法制备的竹红菌乙素纳米粒形态规则，分散佳，纳米粒直径为 50-200nm，成均匀球形。
[0028] 本发明的有益效果：
[0029] (1)聚乙二醇-聚乳酸为两亲性聚合物，其组成的纳米粒既可以有效地溶于水溶 液，其内部疏水区域可以为脂溶性药物提供空间，从而提高光敏剂的水溶性，改变其在体内 的分布，从而提高药物的疗效。聚乳酸在体内分解为单体乳酸，可以在肝内转化为葡萄糖， 从而提供能量。而聚乙二醇是美国食品药品管理局（FDA)批准可用于人体的高分子化合 物。叶酸是一种人体重要的营养物质，参与人体多种重要的代谢反应。因此，上述材料制备 的纳米粒对人体毒副作用较小。此外，一般的聚乙二醇-聚乳酸聚合物较多见，但本次使用 的聚乙二醇-聚乳酸聚合物有端氨基（其结构为H2N-PEG-b-PLA)，可以连接叶酸基团，就增 加了纳米粒的作用效果。
[0030] (2)本发明制备的纳米粒经透射电镜观察，形态呈球形，规则，分散性佳，均匀不粘 连。经动态光散射仪粒径测定，不同胶束粒径在120-130nm左右，粒径分布图呈正态分布， 进一步证明胶束形态规则均一，分散均匀，优化的制备方案是成功的。药物包封率较高。药 物胶束溶液在常温下放置一周，无药物释放出，进一步证实药物包封入纳米颗粒的核心，且 较稳定。
【附图说明】
[0031] 图1为空白纳米胶束的透射电镜图；
[0032] 图2为空白纳米胶束的粒径分布；
[0033] 图3为竹红菌乙素纳米胶束透射电镜图；
[0034] 图4为竹红菌乙素纳米胶束的粒径分布。
【具体实施方式】
[0035] 下面结合实施例对本发明作进一步的说明，应该说明的是，下述说明仅是为了解 释本发明，并不对其内容进行限定。
[0036] 实施例1 :竹红菌乙素纳米粒制备条件的优化
[0037] 1.制备方法的考察
[0038] 分别采用旋转蒸发法、透析法和旋转蒸发透析法进行纳米粒的制备，旋转蒸发法 将药物及纳米材料的溶液滴加到水中，以一定的转速搅拌获得胶束溶液。而