培养孔中补加100WRPMI-1640完全培养基；设置不同的提取物作用浓度， 土荆芥氯仿相提取物溶液按照终浓度为500吒/ml，250吒/ml，125l^g/ml，62.5l^g/ml， 31. 25吒/ml，15. 63吒/ml和7. 81吒/ml每个处理设置5个重复孔。
[0025] 对照组：非小细胞肺癌A549的培养孔内加入DMS0,每孔加入1W，然后再向每个培 养孔中补加100WRPMI-1640完全培养基，一共设置5个DMSO阴性对照孔。
[0026] 将上述培养板置于37°C，5%C02的培养箱内继续培养72hrs。
[0027] 72hrs后向每孔加入20W新鲜配制的浓度为5mg/ml的四甲基偶氮唑盐（MTT)溶 液，并在37°C，5%C02的条件下继续培养4hrs后小心吸弃上清。每孔加入IOOW的DMS0,室 温下震荡lOmin，在多功能酶标仪上测定各孔在490nm处的吸光值（0D值)，按公式计算癌细 胞生长抑制率：癌细胞增殖抑制率=(对照孔测定的平均OD值-加药组测定的平均OD值） /对照孔测定的平均OD值X100%。
[0028] 利用GraphPadPrism5软件对结果进行分析处理，得到土荆芥全株植物氯仿相提 取物对非小细胞肺癌A549作用72hrs后的半数抑制浓度（IC5tl),结果如下表1所示： 表1
土荆芥全株植物的氯仿相提取物对A549细胞分别作用24hrs、48hrs、72hrs后生长抑 制的剂量-效应柱形图如图1所示。结果显示随着提取物处理细胞浓度的增加及作用时间 的延长，其对A549细胞的生长抑制明显的增加，呈现明显的剂量-时间依赖效应。
[0029] 细胞克隆形成试验： A549细胞进入对数生长期后，加入0. 25%的EDTA-胰蛋白酶溶液消化细胞。用RPMI1640培养液将细胞稀释成密度为200个/ml的细胞悬液，加入6孔细胞培养板中，每孔加 入Iml肿瘤细胞悬液。待细胞贴壁24hrs加入向每个孔中各加入10y1的终浓度为7. 81， 15. 63, 31. 25,62. 5,125Pg/ml和250l^g/ml氯仿相相提取物，对照组加入10y1的DMS0,再 向每个孔补加Iml的RPMI-1640培养基；继续培养12天后弃培养基，4%多聚甲醇固定，结晶 紫染色，显微镜下观察，计算细胞数大于50的细胞克隆数；结果如图2所示，随着提取物浓 度的增加，形成的细胞克隆数目明显的减少，提取物对细胞的毒性呈现明显的剂量依赖性。
[0030]Hoechst33342 染色试验： A549细胞进入对数生长期后，加入0. 25%的EDTA-胰蛋白酶溶液消化细胞。用RPMI1640培养液将细胞稀释成密度为IXIO5个/ml的细胞悬液，加入24孔细胞培养板中，每 孔加入Iml肿瘤细胞悬液。待细胞贴壁24hrs加入向每个孔中各加入10y1的土荆芥氯 仿相提取物(终浓度为74. 56yg/ml)，对照组加入10y1的DMS0,再向每个孔补加Iml的 RPMI1640培养基，继续培养24hrs。弃掉培养基，PBS洗1遍，4%多聚甲醛固定15-20min， PBS洗2遍，Hoechst33342染色室温下避光染色30min，PBS洗2遍，用倒置荧光显微镜蓝色 荧光观察、拍照。结果如图在土荆芥氯仿相提取物IC5tl浓度（74. 56yg/ml)时如图3B所示 与细胞对照组（图3A)相比，加药物的细胞出现核染色质皱缩，出现月牙形或者是断裂的片 段，亮度增加，明显的细胞早期凋亡的细胞学表型 细胞周期检测： A549细胞进入对数生长期后，加入0. 25%的EDTA-胰蛋白酶溶液消化细胞。用RPMI1640培养液将细胞稀释成密度为5XIO5个/ml的细胞悬液，加入6孔细胞培养板中，每孔 加入Iml肿瘤细胞悬液。接种后继续培养24hrs向孔中各加入10y1的土荆芥氯仿相提取 物(终浓度为74. 56yg/ml)，对照组加入10y1的DMS0,再向每个孔补加Iml的RPMI-1640 培养基，继续培养24hrs。用胰酶消化细胞，1000 g离心3-5分钟沉淀细胞。小心吸除上清加 入Iml冰浴预冷的PBS，重悬细胞，再次离心沉淀细胞，小心吸除上清。再次加入Iml冰浴预 冷的PBS，重悬细胞。1000 g离心3-5分钟沉淀细胞，75%冰浴预冷的95%乙醇重悬细胞混匀 后4°C固定24hrs。洗去固定液，碘化丙啶染色室温下避光孵育30min，流式细胞仪检测，其 结果用Flowjo. 7. 6软件进行分析。结果如图4所示土荆芥全株植物氯仿相提取物以IC5tl 的浓度处理细胞后（图4B)，与对照组细胞（图4A)相比细胞周期明显的阻滞在Gl期，结果显 示细胞周期阻滞在Gl期（X土SD，n=3VS空白对照，*P〈0. 05, #P〈0. 01，*#P〈0. 001)。[0031] 细胞凋亡检测： A549细胞进入对数生长期后，加入0. 25%的EDTA-胰蛋白酶溶液消化细胞。用RPMI1640培养液将细胞稀释成密度为5XIO5个/ml的细胞悬液，加入6孔细胞培养板中，每孔加 入Iml肿瘤细胞悬液。接种后继续培养24hrs加入IOyl土荆芥氯仿相提取物(终浓度为 74. 56yg/ml)，对照组加入10y1的DMS0,再向每个孔补加Iml的RPMI-1640培养基，继续 培养24hrs。用4°C预冷的PBS洗细胞两次，用250y1结合缓冲液重新重悬细胞，加入5y1 AnnexinV/FITC和IOyl20yg/ml的碘化丙啶溶液，混匀后于室温避光孵育15min。用流 式细胞仪检测，其结果用Flowjo. 7. 6软件进行分析。结果如图5所示土荆芥全株植物氯仿 相提取物以IC5tl的浓度处理细胞后（图5B)，与对照组细胞（图5A)相比提取物能明显的引 起细胞的凋亡作用。结果：提取物诱导细胞早期凋亡（X土SD，n=3VS空白对照，*P〈0. 05， **P〈0. 01，*#P〈0. 001)。
【主权项】
1. 土荆芥全株植物提取物在制备抗非小细胞肺癌药物中的应用。2. 根据权利要求1所述的土荆芥全株植物提取物在制备抗非小细胞肺癌药物中的应 用，其特征在于，所述土荆芥全株植物提取物的制备方法具体包括以下步骤： (1) 利用乙醇对土荆芥枝叶进行浸泡过夜，然后超声提取至少3次，每次提取0. 5~2h， 减压抽滤得到乙醇提液，再多次用相同体积的乙醇浸泡并重复第一次的提取流程，直到乙 醇提取液无色为止，最后合并所有的乙醇提取液； (2) 利用旋转蒸发仪对土荆芥枝叶的乙醇提取液进行减压蒸馏，得到乙醇提取物浸膏， 然后用蒸馏水对其进行溶解； (3) 利用石油醚有机溶剂对土荆芥枝叶乙醇提取物的水溶液进行多次萃取，直到萃取 相无色为止，再将萃取余液用氯仿进行多次萃取直至无色，合并多次萃取液得氯仿相萃取 物。3. 根据权利要求2所述的土荆芥全株植物提取物在制备抗非小细胞肺癌药物中的应 用，其特征在于：所述超声提取的温度为50~80°C，功率为200W。4. 根据权利要求2所述的土荆芥全株植物提取物在制备抗非小细胞肺癌药物中的应 用，其特征在于：所述乙醇的体积百分比浓度为95%。
【专利摘要】本发明公开了土荆芥全株植物提取物的新用途，属于药物、天然药物技术领域。土荆芥全株植物氯仿相提取物在制备抗非小细胞肺癌药物中的应用。所述提取物的制备方法如下：以95%乙醇为提取剂，利用超声提取法对土荆芥全株进行提取，得到其乙醇总提物，先用石油醚萃取，再将萃取余液用氯仿萃取，浓缩萃取液得到氯仿相提取物；本发明所提供的土荆芥全株植物的氯仿相提取部分对非小细胞肺癌A549细胞具有明显的抑制细胞增殖及诱导细胞凋亡作用。
【IPC分类】A61P35/00, A61K36/185
【公开号】CN104887725
【申请号】CN201510263662
【发明人】赵扬, 赵婷, 李拓, 梁超, 潘卉, 冯阳
【申请人】昆明理工大学
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年5月22日