一种水产生物制剂及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及农业领域水产养殖病害防治领域，一种水产生物制剂及其制备方法和 应用，本发明所述的水产生物制剂特别适用于防治水产动物细菌性疾病。
【背景技术】
[0002] 目前，用抗生素治疗水产动物的细菌性疾病所产生的严重药物残留及病原菌抗药 性使水产类食品的安全问题日益突出，影响了人类健康和水产养殖业的可持续发展。虽然 很多抗生素类渔药，如氯霉素、呋喃西林、环丙沙星等已被禁用，但是由于没有高效而廉价 的替代品，抗生素仍然作为主要的抑菌药物被使用。伴随着抗生素的滥用，水产病原菌的 耐药性呈增长趋势，并产生了多重耐药性菌株（李甘强，水产细菌耐药性的最新研宄概 况.农业与技术，2014,84(7) : 176)。随着人们环保意识的加强和对食品安全要求的提高， 从动植物中寻找和提取广谱、高效、低毒、天然的新型抑菌和杀菌物质的研宄已成为当前生 物渔药研宄的热点（张传亮，李小飞，余为一.水产动物常见病原菌的耐药性分析及中草药 体外抑菌活性的检测.中国微生态学杂志，2007, 19(2) :152-157)。
[0003] 食药用真菌作为一种可食药用的大型真菌，具有较高的营养价值和药用价值，已 被广泛应用于保健品行业。食药用真菌本身为人类的天然食品，对人、畜牧和水生动物无毒 害作用，经代谢后，又无残留。目前，已发现某些食（药）用菌的子实体、菌丝体或发酵液中 的代谢产物具有一定的抑菌活性（张秋胜，徐丙莲，刘林德，刘浩，程显好，张玉香，10种真 菌深层发酵液抑菌活性分析，中国酿造，2010,9 :70-72)。该抑菌效果仅是针对普通的细菌 (如大肠杆菌、金黄色葡萄球菌），且其液体发酵培养基为土豆浸出物，不适合工业规模化 和标准化生产需要。
[0004] 目前水产动物的细菌性疾病的治疗方法，主要有抗生素、植物源的杀菌剂等。抗生 素易产生耐药性和环境问题，正逐渐限制。而植物源的杀菌剂，主要来源是中药材，如苦参、 黄柏等，但中药材来源的生物抑制和杀菌剂，因材料采集困难、批次不稳定、费用较高。
[0005] 针对上述问题，申请人通过对黄伞和九州虫草深层发酵液对水产致病菌的体外抑 菌实验，发现真菌深层发酵液对水产养殖病原菌的抑制活性。黄伞与九州虫草深层发酵液 对四种常见的病原菌，如嗜水气单胞菌和迟缓爱德华氏菌；藻弧菌和鳗弧菌等均具有较强 的抑菌和杀菌活性，且这种抑菌和杀菌活性对发酵液的PH值和温度具有广适应性。
[0006] 九州虫草深层发酵液对四种病原菌的抑菌活性强于黄伞深层发酵液。两种真菌深 层发酵液的混合物后对嗜水气单胞菌和迟缓爱德华氏菌的抑菌活性较单一发酵液的明显 增强；两种发酵液的混合物对溶藻弧菌的抑菌活性较单一九州虫草发酵液的有所减弱，但 仍强于单一黄伞发酵液。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的在于提供了一种水产生物制剂，该水产生物制剂的主效成分为黄伞 发酵液与九州虫草的发酵液，黄伞发酵液与九州虫草发酵液的体积比优选为3:2。
[0008] 本发明的另一个目的在于提供了一种水产生物制剂的制备方法。该方法生产简 单，方便易行，适于规模化生产。
[0009] 本发明的另一个目的在于提供一种水产生物制剂在制备防治水产动物细菌性疾 病药物中的应用，本发明提供的水产生物制剂的抑菌和杀菌率达到86. 45%，大大减少了水 体中养殖对象的发病率。
[0010] 为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：
[0011] -种水产生物制剂，该水产生物制剂的主效成分为黄伞发酵液与九州虫草的发酵 液，黄伞发酵液与九州虫草发酵液的体积比优选为3:2。
[0012] 一种水产生物制剂，其制备方法包括：
[0013] 将3块0. 5cm2大小的活化黄伞或九州虫草菌丝块接种于装有200ml的液体发酵 培养基的1000 ml的三角瓶中，放置在旋转摇床上，在26°C条件下，150rpm震荡培养4d。
[0014] 所述的液体发酵培养基：马铃薯可溶性淀粉100g、葡萄糖20g、益植素0. 15g、复合 维生素B10. 0mg、MgS04. 7H20 0? 5g、水 1000ml。
[0015] 黄伞和九州虫草发酵菌液过滤菌丝体后进行混合，即得。
[0016] 以上所述的方法，优选的，黄伞或九州虫草在26°C条件下，150rpm震荡培养4d后， 可根据生产规模，按1 %的接种量进行大型发酵培养，大型发酵培养参数按本领域的常规参 数即可。
[0017] 以上所述的方法，优选的，发酵完毕后，将黄伞或九州虫草发酵菌液分别用三层纱 布滤去菌丝体，得到发酵液，再将发酵液用旋转蒸发仪浓缩，按照体积比浓缩20倍，取上 清，即获得浓缩了 20倍的黄伞或九州虫草深层发酵液。
[0018] 以上所述的方法，优选的，黄伞发酵液与九州虫草发酵液的体积比优选为3:2。
[0019] 以上所述的方法，黄伞及九州虫草的活化使用的是PDA固体培养基：去皮马铃薯 200g、葡萄糖 20g、琼脂 18g、水 1000ml。
[0020] 一种水产生物制剂在制备防治水产动物细菌性疾病药物中的应用，包括与水产类 饲料进行混合投喂，或直接向养殖水体泼洒施用，特别适用于鱼类细菌性疾病的防治。
[0021] 与现有技术相比，本技术具有以下特点
[0022] 1、首次发现了黄伞深层发酵液和九州虫草深层发酵液的混合物对四种常见的水 产病原菌（如嗜水气单胞菌和迟缓爱德华氏菌；藻弧菌和鳗弧菌等）均具有较强的抑制和 杀灭活性；同时，黄伞深层发酵液与九州虫草深层发酵液混合后，对常见水产病原菌抑制和 杀菌效果比单一真菌发酵液效果更好。
[0023] 2、真菌发酵液往往作为发酵工业的废液直接排放，一方面会污染水资源环境，同 时还造成资源浪费，因此，本发明可为大型食药用真菌发酵液实现工农业费弃物资源化 (即"变费为宝"）提供理论基础，也开拓了食药用真菌发酵液在水产病害防治中的应用。因 此，该水产生物制剂的生产，成本低廉。
[0024] 3、真菌深层发酵液抑菌和杀菌活性具有pH值和温度的广适应性，在pH值为 3. 0-9. 0的范围内，黄伞和九州虫草发酵料的抑菌和杀菌活性变化不大，表现出一定的稳定 性，在水产养殖中，正常养殖水体的PH值多为中性或弱碱性。因此，黄伞和九州虫草发酵料 的抑菌和杀菌活性将不受养殖水体pH值变化的影响。
[0025] 4、本由黄伞深层发酵液和九州虫草深层发酵液组成的生物抑菌和杀菌剂，具有选 择性。对水体中的病原微生物（如嗜水气单胞菌）具有明显的抑制和杀灭作用，且使其不 产生耐药性，但对水体中藻类无抑制和杀灭作用。
[0026] 5、该水产生物抑菌和杀菌剂，具有良好的稳定性（即品质稳定、热稳定和耐储 存）。在发酵时，采用发明的标准化配方，发酵过程和后期处理，均实行数值化，达到每批次 生产的产品质量一致性。该生物制剂，在l〇〇°C沸水中处理20min，抑菌和杀菌活性不受影 响。在发酵培养基中添加益植素，黄伞和九州虫草的胞外产物中抑菌和杀菌物质产生更多。 在生产中采用浓缩，使其中抑菌和杀菌物质浓度更高，且更耐储存。
【附图说明】
[0027] 图1为黄伞和九州虫草的单一深层发酵液及两者的深层发酵液混合后的抑菌和 杀菌活性比较示意图。
[0028]a，黄伞深层发酵液的抑菌圈；b，九州虫草深层发酵液的抑菌圈；C，黄伞和九州虫 草深层发酵液按3:2比例混合后的抑菌圈；d，黄伞和九州虫草深层发酵液按3:2比例混合 后并加热处理后的抑菌圈。
【具体实施方式】
[0029] 本发明所述技术方案，如未特备说明，均为常规技术，所用试剂或原料，如未特别 说明，均购自商业渠道。
[0030] 菌株来源：黄伞（Pholiotaadiposa，CFCC6160)和九州虫草（Cordyceps kyusyuensisA.Kawam，CFCC89250)来自中国林业微生物保藏管理中心。嗜水气单胞菌 (Aeromonashydrophila，ATCC7966)、暢弧菌（Vibrioanguillarum，ATCC19019)、溶藻弧菌 (Vibrioalginolyticus，ATCC17749)、迟缓爱德华氏菌（Edwardsiellatarda，ATCC15947) 来自美国模式培养物集存库。
[0031] 实施例1 :
[0032] 一种水产生物制剂，包括以下制备步骤：
[0033] 1.黄伞深层发酵液的制备：
[0034] I. 1将黄伞接种于PDA固体培养基平板上，26°C培养，经两次转接活化后，获得活 化的黄伞菌株。
[0035] 1. 2用接种针钩刮取3块0. 5cm2大小的活化黄伞菌丝块接种于装有200ml液体发 酵培养基的1000 ml的三角瓶中，放置在旋转摇床上，在26°C条件下，150rpm震荡培养4d。
[0036] 1. 3分别收集和浓缩每个锥形瓶中的发酵液。将黄伞发酵菌液分别用三层纱布滤 去菌丝体，得到发酵液，再将发酵液用旋转蒸发仪浓缩，按照体积比浓缩20倍，取上清，即 获得浓缩了 20倍的黄伞深层发酵液，用于以下实施例。
[0037] 所述的液体发酵培养基：马铃薯可溶性淀粉100g、葡萄糖20g、益植素0. 15g、复合 维生素B10. 0mg、MgS04. 7H20 0? 5g、水 1000ml。
[0038] 所述的PDA固体培养基：去皮马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂18g、水1000ml。
[0039] 2.九州虫草深层发酵液的制备：
[0040] 2. 1将九州虫草接种于PDA固体培养基平板上，26°C培养，经两次转接活化后，获 得活化的九州虫草菌株。
[0041] 2. 2用接种针钩刮取3块0. 5cm2大小的活化九州虫草的菌丝块接种于装有200ml 的液体发酵培养基的/1000ml的三角瓶中，放置在旋转摇床上，在26°C条件下，150rpm震荡 培养4d。
[0042] 2. 3分别收集和浓缩每个锥形瓶中的发酵液。将九州虫草发酵菌液用三层纱布滤 去菌丝体，得到发酵液，再将发酵液用旋转蒸发仪浓缩，按照体积比浓缩20倍，取上清，即 获得浓缩了 20倍的九州虫草深层发酵液，用于以下实施例。
[0043] 所述的液体发酵培养基：马铃薯可溶性淀粉100g、葡萄糖20g、益植素0. 15g、复合 维生素B10. 0mg、MgS04. 7H20 0? 5g、水 1000ml。
[0044] 所述的PDA固体培养基：去皮马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂18g、水1000ml。