[0045] 3.将步骤1和步骤2制备得到的黄伞和九州虫草深层发酵液按体积比3:2进行混 合，即得本发明的水产生物制剂，用于以下实施例。
[0046] 实施例2 :
[0047] 黄伞深层发酵液和九州虫草深层发酵液的抑菌和杀菌效果检测：
[0048] 1、黄伞深层发酵液的抑菌和杀菌活性
[0049] 本步骤所用的发酵液为实施例1制备的浓缩了20倍的黄伞深层发酵液。
[0050] 采用经典的管碟法进行抑菌和杀菌活性测定。即下层为1. 6%琼脂培养基，上层用 0.8%琼脂培养基。每种深层发酵液料在3个定制培养皿中进行平行实验。牛津杯（内径 6. 0mm，外径7. 8mm，高10mm)。每个牛津杯中加200y1的发酵液，每个抑菌圈直径米用十字 交叉法，游标卡尺测3次，取平均值。方差分析用SPSS11.5统计分析软件，采用Duncan新 复极差法（P= 〇. 05)检验显著性。
[0051] 灭活处理采用将发酵液转移至无菌管中，100°C沸水中加热20min。样品室温自然 冷却后备用。
[0052] 结果表明：黄伞深层发酵液及其加热灭活深层发酵液对四种水产病原菌均有较好 的抑菌和杀菌活性，抑菌圈直径均达到了 8. 50mm以上；两者差异小，表明黄伞发酵料抑菌 和杀菌活性具有热稳定性（表1)。其中对迟缓爱德华氏菌的抑菌和杀菌活性，正常和热处 理的深层发酵液的抑菌圈直径分别为12. 44和12. 82mm，差异不明显。总的来看，本发明获 得的黄伞深层发酵液对四种水产病原菌抑菌和杀菌活性大小：迟缓爱德华氏菌〉嗜水气单 胞菌〉鳗弧菌〉溶藻弧菌。
[0053] 表1.黄伞发酵液的抑菌和杀菌圈直径（mm)(n= 9)
[0054]
[0055] 2、九州虫草深层发酵液的抑菌和杀菌活性
[0056] 采用经典的管碟法进行抑菌和杀菌活性测定和加热灭活处理发酵料，方法均同前 1所述。本步骤所用的发酵液为实施例1制备的浓缩了 20倍的九州虫草深层发酵液。
[0057] 结果表明：九州虫草深层发酵液对四种水产病原菌均有较好的抑菌和杀菌活性， 抑菌和杀菌圈直径均在9. 30mm以上；加热处理对九州虫草深层发酵液抑菌和杀菌活性影 响较小（见表2)。九州虫草发酵料对鳗弧菌和溶藻弧菌抑菌和杀菌活性较明显。总的抑菌 和杀菌活性比较：溶藻弧菌〉鳗弧菌〉迟缓爱德华氏菌〉嗜水气单胞菌。
[0058] 表2.九州虫草发酵液的抑菌和杀菌圈直径（mm)(n= 9)
[0059]
[0061] 3.黄伞深层发酵液和九州虫草深层发酵液的不同比例混和对嗜水气单胞菌的影 响
[0062] 将实施例1制备的浓缩了20倍的黄伞深层发酵液和九州虫草深层发酵液按不同 的比例进行混和后，以嗜水气单胞菌为待测菌株进行抑制和杀菌活性试验。不同的比例关 系如下：4:1 ;3:2 ;1:1 ;2:3 ;1:4。
[0063] 采用管碟法进行抑菌和杀菌活性测定，方法均同前1述。
[0064] 表3.黄伞深层发酵液和九州虫草深层发酵液的混和物抑菌和杀菌圈直径（mm)(n =9)
[0065]
[0066] 实施例3 :
[0067] 温度对水产生物制剂的影响：
[0068] 本实施例采用的是实施例1步骤3制备黄伞和九州虫草深层发酵液按体积比3:2 进行混合得到的水产生物制剂，灭活处理采用将水产生物制剂转移至无菌管中，l〇〇°C沸水 中加热20min。样品室温自然冷却后备用。
[0069] 水产生物制剂的效果检测：
[0070] 结果表明：实施例1制备的水产生物制剂及其灭活后均有较好的抑菌活性，抑菌 圈直径都在10.OOmm以上。加热处理对水产生物制剂的抑菌活性影响较小，有的不是下降， 而是增强，如加热前水产生物制剂对溶藻弧菌抑菌圈直径为13. 85mm;加热处理后，水产生 物制剂对溶藻弧菌抑菌圈直径为14. 17mm(表4)。总的来看，水产生物制剂对水产病原菌的 抑菌活性：鳗弧菌〉溶藻弧菌〉迟缓爱德华式菌〉嗜水气单胞菌。
[0071] 表4.该水产生物剂的抑菌和杀菌活性（n= 9)
[0072]
[0074] 水产生物制剂对pH值的稳定性检测：
[0075] 制备而成的水产生物制剂的pH值为7. 25。实验结果表明，不同pH条件下处理该 制剂，其在pH= 5. 0 - 9. 0的范围内，抑菌圈直径变化不大，抑菌活性很稳定。以嗜水气单 胞菌为例，该生物抑制和杀菌剂在pH= 3. 0-11. 0范围内，在不同pH值下变化不明显。该 制剂在不同pH值处理后的抑菌和杀菌圈直径见表5。
[0076] 表5.不同pH处理后水产生物制剂对嗜水气单胞菌的抑菌和杀菌活性（n= 9)
[0077]
[0078] 注：数据表示为平均值土标准差（x±SD).
[0079] 水产生物制剂在水体中的使用效果检测：
[0080] 取4个水族箱，分别装入IOL天然养殖水体，加入制备好的嗜水气单胞菌菌液（菌 液浓度为IX106CFU/ml，混和均匀后，再分别加入0.Iml水产生物制剂，混匀。在养殖水样的 0min、30min、60min、120min时，分别取水样进行稀释涂布肉汤培养基平皿中，28°C恒温培养 20h，每组试验设3个平行试验。记录菌落数并计算抑菌和杀菌率。
[0081]
[0082] 结果表明：本发明实施例1制备的生物抑制和杀菌剂，在养殖水体中，对水产病原 菌具有明显的抑菌和杀菌活性，且这种抑菌和杀菌活性，随着时间的变化，变化幅度较小， 差异不明显，说明该生物抑制和杀菌剂在水体中的使用效果稳定。见表6。
[0083] 表6.该水产生物制剂的抑菌和杀菌率与时间的关系（mm)(n= 9)
[0084]
[0085] 实施例4 :
[0086] 本实施例采用的是实施例1步骤3制备黄伞和九州虫草深层发酵液按体积比3:2 进行混合得到的水产生物制剂。
[0087] 水产生物制剂的治疗试验
[0088] 使用供试的病原菌腹腔注射感染试验鱼（异育银鲫），病原菌（嗜水气单胞菌）的 浓度约为IX106CFU/ml，每尾鱼注射0.lml。24h后，投喂混合有水产生物制剂的饲料（制 剂与饲料的混合比例为5ml/Kg)，连续治疗7天，观察并记录试验鱼的病变情况及统计其成 活率。试验鱼先暂养1周后开始试验，治疗试验组用鱼32尾，同时设立对照组，阴性对照组 仅投喂普通饲料，未注射病原菌；阳性对照组，投喂普通饲料，注射病原菌。
[0089] 表7.该水产生物制剂对异育银鲫的细菌性出血病的防治试验
[0090]
[0091] 实施例5:
[0092]
[0093] -种水产生物制剂在制备防治水产动物细菌性疾病药物中的应用，应用过程如 下：
[0094] 本实施例采用的是实施例1步骤3制备黄伞和九州虫草深层发酵液按体积比3:2 进行混合得到的水产生物制剂。
[0095] 2012年，山东济南长清区养殖户曲某，养殖池塘30亩，主养鲤，8月份暴发了细菌 性流行疾病。鱼体的主要症状是体内外广泛充血和出血，部分鱼眼球突出，腹部膨大，有腹 水，肝、脾、肾肿大，日死亡鱼百尾以上。经用本实施例1中的水产生物制剂全池泼洒治疗3 天后，使其浓度达到〇. 5ppm，池塘死鱼明显减少。以后采用喷洒拌饵投喂的方式连用5天 (25ml/5kg饲料），至10月底未再发病。本防治方法在同村的张某的一口 20亩池同样应用， 也获得相同的效果。
[0096] 该水产生物制剂，对鱼类具有较高的生物安全性。在2013年7月，湖北黄岗白谭 湖渔场的张某，承租多口池塘进行养鱼，在一口 2亩的主养草鱼的鱼池中，暴发了细菌性出 血病，张某眼见池中每天有死鱼，心急，按该水产生物制剂与饲料的混合比例为20ml/Kg进 行喷洒拌料投喂，投喂后，死鱼明显减少。待池中未见死鱼后，张某继续按此高剂量喷洒拌 料投喂，也未见鱼类因该制剂浓度高而死亡的现象。
【主权项】
1. 一种水产生物制剂，所述的水产生物制剂的主效成分为黄伞发酵液与九州虫草的发 酵液。2. 根据权利要求1所述的制剂，所述的黄伞发酵液与九州虫草发酵液的体积比为3:2。3. 权利要求1所述的水产生物制剂的制备方法，包括： 将3块0. 5cm2大小的活化黄伞或九州虫草菌丝块接种于装有200ml的液体发酵培 养基的1000ml的三角瓶中，放置在旋转摇床上，在26°C条件下，150rpm震荡培养4d; 所述的液体发酵培养基：马铃薯可溶性淀粉100g、葡萄糖20g、益植素0.15g、复活 维生素B10.0mg、MgS04.7H20 0.5g、水 1000ml; 黄伞和九州虫草发酵菌液过滤菌丝体后，分别经浓缩后，按比例混合，即得。4. 根据权利要求3所述的方法，发酵完毕后，将黄伞或九州虫草发酵菌液分别用三层 纱布滤去菌丝体，得到发酵液，再将发酵液用旋转蒸发仪浓缩，按照体积比浓缩20倍，取上 清，获得浓缩了 20倍的黄伞或九州虫草深层发酵液，再将黄伞深层发酵液与九州虫草深层 发酵液的按体积比为3:2进行混合。5. 权利要求1所述的制剂在制备防治水产动物细菌性疾病药物中的应用。6. 根据权利要求5所述的应用，所述的细菌为鳗弧菌、溶藻弧菌、迟缓爱德华式菌或嗜 水气单胞菌中的一种或几种。7. 根据权利要求5所述的应用，所述的水产动物为鱼类。8. 权利要求1所述的制剂在制备同时防治水产动物鳗弧菌疾病、溶藻弧菌疾病、迟缓 爱德华式菌疾病和嗜水气单胞菌疾病中的应用。
【专利摘要】本发明公开一种水产生物制剂及其制备方法和应用。该生物抑制和杀菌剂是由黄伞和九州虫草真菌经活化、液态发酵、旋转浓缩和按比例混合配制而成，其对水产病源微生物具有较强抑制和杀菌活性，专一性好，对鱼体无损害；本生物制剂生产的菌株本身为人类的食用真菌，因此，该生物抑制和杀菌剂对鱼类和人类无毒害作用，安全性好。将选育的黄伞和九州虫草菌株分别活化和逐级扩大液态发酵，分别浓缩后可按3:2比例混后，可单独使用，也可通过喷洒在饲料上，拌饵使用。本生物制剂制备方法简单，可规模化生产，效果明显，对常见水产病原菌均具有明显的抑制和杀灭活性。
【IPC分类】A61P31/04, A61K36/07
【公开号】CN104887720
【申请号】CN201510187337
【发明人】聂品, 张秋胜, 张金, 刘志新
【申请人】中国科学院水生生物研究所, 武汉人鱼水生物工程有限公司
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年4月20日