一种免疫增强试剂的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物医学领域，具体涉及一种免疫增强试剂，可以在体外提高免疫细 胞的激活、增殖及细胞因子释放能力。
【背景技术】
[0002] 免疫细胞激活过程中受许多表面分子精密的调节，有的促进免疫细胞激活；有的 则是抑制性受体分子，负责传递抑制信号，以防止免疫系统过度活化。这些刺激或抑制免疫 细胞激活的分子，通常被称为免疫检查点，或免疫检查点分子，免疫开关分子等。
[0003] 免疫检查点包括细胞毒T淋巴细胞相关抗原4(cytotoxicT lymphocyte-associatedantigen-4,CTLA-4)和程序性死亡受体 1 及其配体（programmed death1，PD-1/PD-L1)信号通路分子以及PD-L2、ID0-1、ID0-2、KIR、0X40、CD70、LAG-3、 TM3等。CTLA-4是T细胞活化的重要下调节因子。在T细胞活化过程中，CTLA-4通过抑 制细胞核内白细胞介素-2 (interleukin-2,IL-2)基因的转录、并直接抑制细胞周期的一 些关键成分的表达从而抑制T细胞的活化和增殖。而ro-1/PD-Ll信号通路也发挥着负性 免疫调节作用。已研宄证明，肿瘤细胞表面广泛高表达ro-Li分子。当T细胞表面的ro-i 与ro-Li耦联后，可导致T细胞胞质区的免疫受体酪氨酸抑制基序结构域的酪氨酸残基磷 酸化，可募集磷酸酶蛋白酪氨酸酶2和蛋白酪氨酸酶1，不仅可阻滞细胞外信号调节激酶的 活化，还可阻断磷脂酰肌醇3-激酶和丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶的激活，最终抑制T淋巴细 胞增殖和相关细胞因子的分泌。同时，细胞因子白细胞介素2 (IL-2)、干扰素Y分泌也减 少。
[0004]由于肿瘤病人体内免疫系统监视平衡被破坏，通过病人自身体内的免疫系统无法 有效清除肿瘤细胞。因此通过将在体外激活和扩增的自体或异体免疫效应细胞回输给肿瘤 患者体内，使其在体内发挥杀伤肿瘤细胞作用的过继性免疫细胞治疗在临床中得以盛行， 包括常用的免疫细胞治疗方法如：细胞因子诱导的杀伤细胞（CIK)疗法、DC联合CIK细胞 疗法、自然杀伤细胞（NK)疗法、肿瘤侵润细胞疗法（TIL)、细胞毒性T淋巴细胞（CTL)的肿 瘤靶向疗法等。
[0005] 但是，肿瘤细胞发展了许多机制以抑制机体的抗肿瘤免疫活性。肿瘤微环境的免 疫抑制主要通过肿瘤细胞及免疫细胞间传递免疫检查点抑制信号进行调控。由于肿瘤患 者体内的免疫抑制微环境，使得这些体外激活的免疫细胞回输体内后仍然无法克服体内的 免疫抑制作用，因此过继免疫疗法在大量的临床试验和应用中体现了其疗效非常低的局限 性（TrajanoskiZ,MaccalliC,MennonnaD,CasoratiG,ParmianiG,DellabonaP (2015)Somaticallymutatedtumorantigensinthequestforamoreefficacious patient-orientedimmunotherapyofcancer.Cancerimmunology,immunotherapy: CII64: 99-104)。
[0006] 因此，很有必要研发一种有效的免疫试剂，封闭免疫检查点介导的免疫负调控，阻 断免疫抑制信号传递，提高从病人血液中在体外分离并扩增的免疫细胞的激活、增殖及细 胞因子释放能力，并进一步杀伤肿瘤细胞，以促进过继免疫疗法取得实质性效果。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的是提供一种提高免疫细胞激活杀伤肿瘤功能的免疫增强试剂，可以 联合封闭一种或多种免疫检查点介导的共抑制信号通路，增加免疫细胞的激活、增殖及细 胞因子释放能力，有效防止肿瘤细胞的免疫抑制，从而提高从患者血液分离出来并扩增的 免疫细胞对肿瘤杀伤的能力。
[0008] 为达到上述发明目的，本发明采用的技术方案为，一种免疫增强试剂，包括携带免 疫检查点抗体分子编码基因的AAV病毒，所述携带免疫检查点抗体分子编码基因的AAV病 毒中，免疫检查点为ro-l、PD-Ll、CTLA_4中的一种或者几种。本发明利用携带不同免疫检 查点抗体分子编码基因的AAV病毒相互组合，通过在体外感染T细胞、自然杀伤细胞、细胞 毒性T淋巴细胞或者细胞因子诱导的杀伤细胞等免疫细胞；被感染的免疫细胞回输至肿瘤 病人体内，并表达分泌免疫检查点的抗体，从而阻断免疫检查点受体及其配体的结合，有效 阻断免疫抑制信号传递，提高了免疫细胞的激活、增殖和分泌细胞因子的能力，破坏免疫肿 瘤抑制微环境，提尚免疫细胞的杀伤能力，从而提尚过继免疫治疗的疗效。本发明针对的肿 瘤细胞免疫检查点为ro-l、PD-Ll、CTLA-4中的一种、两种或者三种，互相之间没有干扰，共 同提尚免疫试剂的效应，从而有效的提尚免疫细胞的杀伤能力。
[0009] 上述技术方案中，所述ro-1抗体分子重链可变区的氨基酸序列为SEQIDNO:1或 者SEQIDNO:3,轻链可变区的氨基酸序列为SEQIDNO:2或者SEQIDNO:4;所述H)-L1抗 体分子重链可变区的氨基酸序列为SEQIDNO:5,轻链可变区的氨基酸序列为SEQIDNO: 6 ;CTLA-4抗体分子重链可变区的氨基酸序列为SEQIDNO:7或者SEQIDNO:9,轻链可变 区的氨基酸序列为SEQIDNO:8或者SEQIDNO:10。
[0010] 上述技术方案中，所述携带免疫检查点抗体分子编码基因的AAV病毒中，编码 I3D-I抗体分子重链可变区序列的DNA序列为SEQIDNO: 11或者SEQIDNO: 13;编码H)-l 抗体分子轻链可变区序列的DNA序列为SEQIDNO: 12或者SEQIDNO: 14;编码H)-L1抗 体分子重链可变区序列的DNA序列为SEQIDNO: 15;编码H)-L1抗体分子轻链可变区序 列的DNA序列为SEQIDNO: 16 ;编码CTLA-4抗体分子重链可变区序列的DNA序列为SEQ IDNO: 17或者SEQIDNO: 19;编码CTLA-4抗体分子轻链可变区序列的DNA序列为SEQID NO: 18 或者SEQIDNO:20。
[0011] 本发明中，携带免疫检查点抗体分子编码基因的AAV病毒中，所携带的DNA片段编 码得到的对应免疫检查点抗体分子也可以存在多种形式，为scFv片段、Fab片段或者全长 抗体。这些分子形式都可以结合免疫细胞或肿瘤细胞上对应的免疫抑制信号通路，阻断免 疫检查点与其配体间的结合，从而阻断肿瘤免疫抑制信号的传递。
[0012] 上述技术方案中，免疫增强试剂还包括生理盐水或者PBS的缓冲液；本领域技术 人员可以根据需要添加。
[0013] 本发明还公开了一种免疫增强体系，由上述携带免疫检查点抗体分子编码基因的 AAV病毒在体外感染T细胞、自然杀伤细胞、细胞毒性T淋巴细胞或者细胞因子诱导的杀伤 细胞制备得到，具体为向含有T细胞、自然杀伤细胞、细胞毒性T淋巴细胞或者细胞因子诱 导的杀伤细胞的培养基中添加上述携带免疫检查点抗体分子编码基因的AAV病毒，培养后 就得到免疫增强体系，其可以回输至病人体内；在病人体内，被感染的免疫细胞通过分泌表 达抗体分子，与免疫检查点结合，封闭免疫检查点介导的共抑制信号通路。所结合的抗原分 子可以是免疫细胞表面的免疫检查点分子，也可以是肿瘤细胞或其他细胞表面的其他参与 免疫抑制或免疫激活的免疫检查点分子。
[0014] 本发明还提供了一种体外增强免疫细胞细胞因子释放能力的方法，包括以下步 骤，向含有T细胞、自然杀伤细胞、细胞毒性T淋巴细胞或者细胞因子诱导的杀伤细胞的培 养基中添加上述携带免疫检查点抗体分子编码基因的AAV病毒，经感染和培养，通过回输 细胞因子释放能力增强的免疫细胞至人体，提高了免疫细胞的激活、增殖和分泌细胞因子 的能力，可以更好的杀死肿瘤细胞。
[0015] 免疫细胞培养基含有细胞因子和其它营养成分，能够支持免疫细胞生长和扩增的 液体，可用于T细胞、CIK、NK等各类免疫细胞的培养。比如CIK细胞培养采用基础培养基 如RPMI1640培养液处理从血液中分离的PBMC细胞，向培养液中INF-y刺激后，之后再加 以CD3单克隆抗体、白细胞介素-2培养，最后用含IL-2的培养液培养即可获得CIK细胞； NK细胞培养基采用基础培养基如RPMI1640并添加粘附因子、IL-2,IL-4,IL-12等细胞免 疫因子等，对NK细胞的生长有较强的刺激或成熟作用，可提高活化免疫细胞的杀伤活性； 人体外周血淋巴细胞培养基主要由RPMI1640、青霉素G钾盐、硫酸链霉素、牛血清、植物血 球凝集素（PHA)等组成。
[0016] 携带免疫检查点抗体分子编码基因的AAV病毒会感染免疫细胞，并进行表达携带 的免疫检查点抗体分子，感染进免疫细胞的病毒不会自我包装或扩增产生具有感染能力的 子代病毒。
[0017] 本发明的携带免疫检查点抗体分子编码基因的AAV病毒由以下步骤制备： (1) 合成编码免疫检查点抗体分子重链全长以及轻链全长的DNA序列，经测序验证正 确后，通过聚合酶链式反应扩增得到重链DNA片段、轻链DNA片段； (2) 以步骤（1)的重链DNA片段、轻链DNA片段为目的片段，以pAAV-MCS-IRES为目的 载体，依次克隆重链DNA片段和轻链DNA片段至上述载体中，并最终测序验证正确后获得包 含全长重链和全长轻链DNA分子的腺相关病毒质粒； (3) 向培养的HEK293细胞中转染步骤（2)的腺相关病毒质粒通过常规方式进行病毒包 装扩增，之后收集细胞裂解液上清后，进行柱纯化得到携带免疫检查点抗体分子编码基因 的AAV病毒； (4) 免疫增强试剂的配制；将步骤（3)获得的携带不同免疫检查点抗体分子编码基因 的AAV病毒中的一种或者几种加入生理盐水或者PBS缓冲液中，得到免疫增强试剂。
[0018] 本发明的免疫增强试剂中，可以单独包含携带ro-1抗体分子编码基因的AAV病 毒、携带ro-Ll抗体分子编码基因的AAV病毒或者携带CTLA-4抗体分子编码基因的AAV病 毒；也可以包含其中的两种或者三种。当携带免疫检查点抗体分子编码基因的AAV病毒为 携带I3D-I抗体分子编码基因的AAV病毒与携带CTLA-4抗体分子编码基因的AAV病毒时，携 带F1D-I抗体分子编码基因的AAV病毒与携带CTLA-4抗体分子编码基因的AAV病毒的病毒 粒子数量比为（6~3) : 1 ;当携带免疫检查点抗