的条带切割下 来，使用DNA凝胶回收试剂盒进行回收。回收PCR产物，得到DNA片段；可获得共10条DNA 片段，其中5条重链全长DNA片段、5条轻链全长DNA片段； 所述引物序列为： 重链前引物（SEQIDN0:24):CCTCGAGATGGGATGGTCCTGTATTATCCTGT重链后引物（SEQIDNO: 25 ):TAGATCTTCACTTGCCCAGGGACAGGGACAGG 轻链前引物（SEQIDN0:26):GAITCGAAGCCGCCACCATGGGATGGTCCTGTATTATCC 轻链后引物（SEQIDN0:27):CGGTCGACCTTATCAGCAITCGCCTCTAITGAAA 针对重链DNA以及轻链DNA分别选择重链、轻链引物。
[0035] (2)腺相关病毒质粒的制备； 取步骤（1)的DNA片段中，H)-l对应的重链全长DNA片段以及与其配对的轻链全长DNA片段；对重链全长DNA片段、目的载体pAAV-MCS-IRES(购自CellBiolabsInc)分别进 行XhoI-BglII双酶切；双酶切体系为DNA片段30yL、酶各取IyL、NEBcutsmartbuffer 5yL，用超纯水补足体积至50yL;双酶切条件为37°C酶切2个小时；将酶切后的重链DNA 片段与线性目的载体按照重链DNA片段：目的载体摩尔比为3 : 1的比例，配制T4连接反 应体系，16°C连接过夜；然后取10UL连接反应产物转化至Stbl3大肠杆菌感受态中，具体 转化程序为将10UL连接产物加入在冰上解冻的Stbl3感受态中，置于冰中30分钟，然后 进行42°C40秒热击，重新置于冰中1分钟，加入lmL37°C预热的LB液体培养基，在培养箱 培养1个小时后，取40yL细菌在含有氨苄抗性的LB琼脂平板上均匀涂布，将LB平板置于 37°C培养箱中过夜培养，待单克隆菌落长出后，挑3-5个单克隆进行摇菌扩大培养；最后使 用质粒小提试剂盒提取质粒并进行测序验证正确后获得携带重链DNA片段的重组阳性质 粒pAAV-Heavy; 对轻链全长DNA片段和上述重组阳性质粒pAAV-Heavy分别进行BstBI-SalI双酶切， 双酶切体系为DNA片段30yL、酶各取IyL、NEBcutsmartbuffer5yL，用超纯水补足体 积至50yL;双酶切条件为37°C酶切2个小时；回收酶切产物得到酶切后的轻链DNA片段以 及酶切载体；将酶切后的轻链DNA片段与酶切载体按照轻链DNA片段：酶切载体摩尔比为 3 : 1的比列，配制T4连接反应体系，18°C连接过夜；然后取连接产物转化至Stbl3大肠杆 菌感受态中，具体转化程序为将10UL连接产物加入在冰上解冻的Stbl3感受态中，置于冰 中30分钟，然后进行42°C40秒热击，重新置于冰中1分钟，加入lmL37 °C预热的LB液体培 养基，在培养箱培养1个小时后，取40yL细菌在含有氨苄抗性的LB琼脂平板上均匀涂布， 将LB平板置于37°C培养箱中过夜培养，待单克隆菌落长出后，挑3-5个单克隆进行摇菌扩 大培养；最后使用质粒小提试剂盒提取质粒并进行测序验证正确后获得携带重链和轻链分 子的腺相关病毒质粒PAAV-IgG;附图1为其结构示意图，抗体分子的轻链和重链DNA片段 亚克隆至pAAV-IRES-MCS载体中，其中轻链DNA片段置于CMV启动子及IRES之间，重链DNA 片段置于IRES序列之后。
[0036] 对其它DNA片段中相互配对的一条重链DNA片段与一条轻链DNA片段；重复上述 步骤，从而获得携带重链和轻链分子的5个腺相关病毒质粒，对应三个免疫检查点抗体分 子。
[0037] (3)在无血清的FreeStyle293培养基中培养HEK293悬浮细胞，维持细胞密度为 2xl06个细胞/mL;转染处理前1天，调整细胞密度为1x10 6细胞/mL，过夜培养；然后离心处 理收集细胞沉淀，用培养基重悬细胞沉淀，调整细胞密度为3xl06个细胞/mL;按照终浓度 为3yg/mL的量添加步骤（2)的携带重链和轻链分子的腺相关病毒质粒，摇床振荡；然按照 终浓度为9yg/mL的量添加PEI，摇床上振荡培养过夜；然后加入与细胞培养液等体积的培 养基稀释细胞，继续培养3天；离心培养体系，收集细胞沉淀后，用PBS重悬细胞沉淀，经冻 融后加入终浓度5U/mL的全能核酸酶，37°C孵育Ih;最后离心处理，吸取上清，进行柱纯化 得到重组腺相关病毒，为携带免疫检查点抗体分子编码基因的AAV病毒；参见表1，本步骤 得到5种重组腺相关病毒，分为三组，也与步骤（1)的DNA序列对应。
[0038] (4)免疫增强试剂的配制；将步骤（3)获得的重组腺相关病毒中的一种或者几种 加入生理盐水或者PBS的缓冲液中，混合，即得免疫增强试剂。本实施例可以获得25类针 对不同免疫检查点组合的免疫增强试剂。
[0039] 实施例二体外细胞因子释放实验验证 采用人淋巴细胞分离液（Lymphoprep)试剂从人外周血中分离外周血单个核细胞 (PBMC细胞)，并使用RPMI1640、10%FBS进行培养，分为空白组、对照组、实验组。
[0040] 第一组在培养基中添加PHA激活外周血T细胞，为空白组；第二组为PHA激活的T 细胞与肿瘤细胞(肺癌细胞HCC829)共培养组，在进行共培养前，首先使用Y干扰素处理肿 瘤细胞24小时，以提高免疫检查点分子配体(如ro-Li分子等）在肿瘤表面的表达水平，然 后通过PBS洗涤三次以去掉培养基中的INF-Y后，加入激活的T细胞进行共培养，为对照 组；实验组是在第二组共培养体系的基础上，分别添加由实施案例一获得的不同的免疫增 强试剂(用生理盐水将病毒滴度调整为同一浓度5XIO13vg/mL);感染48小时后。分别取 上述各组体系的培养基上清，采用ELISA检查细胞因子IL2、IFN-y等的分泌表达。
[0041] 在实验组中，第一种免疫增强试剂所包含病毒组合为I-1:111-5=1:1 ; 第二种组合为11-3:111-4=3:1 ;第三种组合为1-2:11-3:111-4=1:3:1 ;第四种 组合为1-1:11-3:111-5=3:3:1 ;第五种组合为1-1:11-3=1:1 ;第六种组合为 1-1:11-3:111-5=1:2:1 ;第七种为1-2 ;第八种为II-3 ;第九种为111-4。病毒代号参见表 1，比例为病毒粒子数量比。
[0042] 细胞因子释放试验结果： 附图2-5为细胞因子分泌表达水平图，其中附图2对应的实验组第一种组合；附图3对 应的实验组第二种组合；附图4对应的实验组第三种组合；附图5对应的实验组第四种组 合。
[0043] 可以看出，PHA激活T细胞后，相应的细胞因子分泌表达水平均显著升高，与肿瘤 细胞共培养后，细胞因子的表达水平均显著降低；添加不同的免疫增强试剂至上述共培养 体系中，随着加免疫增强试剂用量的增多，受到肿瘤细胞抑制的T细胞分泌细胞因子（IL-2 和IFN-Y)的能力逐步提高，甚至恢复到没有肿瘤细胞存在抑制的水平。
[0044] 由于肿瘤细胞表面表达免疫抑制检查点蛋白的配体，通过受体与配体的结合，向 T细胞传递了负调控信号，导致T细胞的细胞因子分泌能力降低；当将携带组合的免疫检 查点蛋白的重组腺相关病毒加入到共培养体系中后，病毒颗粒进入到T细胞中，大量表达 免疫抑制检查点蛋白抗体，表达的重组抗体与T细胞表面的免疫抑制检查点蛋白结合或者 与肿瘤细胞表面的相关配体结合后，阻断了这种肿瘤细胞表面配体与T细胞表面受体的结 合，从而防止肿瘤细胞向免疫细胞传递负调控信号，实现T细胞的持续激活和对肿瘤细胞 的持续杀伤作用。
[0045] 实施例三分泌免疫检查点抗体的免疫细胞对肿瘤细胞的诱导凋亡作用 采用人淋巴细胞分离液（Lymphoprep)试剂从人外周血中分离外周血单个核细胞(peripheralbloodmononuclearcell，PBMC)细胞，并使用RPMI1640、10%FBS进行培养。 在培养基中添加PHA激活外周血T细胞作为效应细胞；使用Y干扰素处理肿瘤细胞24小 时，以提高肿瘤细胞表面的免疫检查点配体分子，如I3D-Ll分子，在肿瘤表面的表达水平， 然后通过PBS洗涤三次以去掉培养基中的Y干扰素，经Y干扰素处理过的肿瘤细胞(肝癌 细胞H印G2)作为靶细胞。将激活的效应细胞分为两组，取其中一组加入实施例一中的一 种免疫增强试剂(免疫检查点腺相关病毒组合1-2:II-3:111-4=1:3:1 )，对效应细胞进行感 染，使其能够分泌表达免疫检查点抗体，在病毒感染48小时后，将表达免疫检查点抗体的 效应细胞与靶细胞进行共培养，作为实验组，另一组效应细胞直接与靶细胞共培养，并做为 对照试验组；共培养48小时后，将靶细胞分为三份，取一部分细胞进行流式细胞分析细胞 周期的改变，另一份细胞采用基因组提取试剂盒，提取全细胞基因组，并进行琼脂糖凝胶电 泳实验，检测凋亡细胞的基因组断裂情况；剩余的细胞进行Hoechst染色，观察细胞核型的 改变。
[0046] 细胞诱导凋亡结果 附图6为细胞周期检测结果。对照组肿瘤细胞G0/G1期细胞比例为45%，S期细胞比例 占22. 8%，G2/M期细胞约为32. 2%，表明细胞生长较为正常，激活的T细胞未对肿瘤细胞的周 期产生显著影响；与对照组相比，实验组中表达免疫检查点抗体的免疫细胞处理肿瘤细胞 后，肿瘤细胞周期出现明显的凋亡，亚G0/G1期细胞约为22. 5%，G0/G1期细胞比例为50%， 而S期和G2/M期细胞比例分别降低为10%和17. 5%。
[0047] 附图7为细胞基因组琼脂糖凝胶电泳实验结果。结果表明，对照组肿瘤细胞的基 因组较为完整(泳道1、2)，而实验组中（泳道3)，由于肿瘤细胞发生凋亡，其基因组DNA断裂 为几百个碱基左右的小分子DNA。
[0048] 附图8为Hoechst细胞核染色结果。图8-A为对照组细胞核，细胞核荧光着色均 匀，图8-B为实验组组细胞核染色结果，细胞核破裂，呈浓染致密的颗粒状荧光，且荧光发 光强度不均一。
[0049] 实施例四免疫增强体系配制 采用人淋巴细胞分离液（Lymphoprep)试剂从人外周血中分离PBMC细胞，并使用淋巴 细胞培养液重悬细胞，在培养基中添加重组人IFN-Y在37°C、5%CO2培养24小时后，向培 养基中添加anti-⑶3、IL-I及IL-2,继续培养48-72小时，进行半量换液，并补充IL-2,连 续培养14天，使用生理盐水洗涤细胞3次，以