体分子编码基因的AAV病毒为携带H)-L1 抗体分子编码基因的AAV病毒与携带CTLA-4抗体分子编码基因的AAV病毒时，携带H)-L1 抗体分子编码基因的AAV病毒与携带CTLA-4抗体分子编码基因的AAV病毒的病毒粒子数 量比为（6~3) :I;当携带免疫检查点抗体分子编码基因的AAV病毒为携带ro-1抗体分 子编码基因的AAV病毒、携带F1D-Ll抗体分子编码基因的AAV病毒与携带CTLA-4抗体分子 编码基因的AAV病毒时，携带H)-l抗体分子编码基因的AAV病毒与携带ro-Li抗体分子编 码基因的AAV病毒的病毒粒子数量与携带CTLA-4抗体分子编码基因的AAV病毒的病毒粒 子数量比为（6~3): 1。如果携带CTLA-4抗体分子编码基因的AAV病毒的病毒粒子数量 过高，则容易产生较强的副反应。
[0019] 本发明利用化学体外全长合成的方法，合成编码免疫检查点抗体分子的重链DNA 分子全长序列和轻链DNA分子全长序列。免疫检查点抗体重链分子包括信号肽、重链可变 区和重链恒定区，轻链分子包括信号肽、轻链可变区和轻链恒定区；对应的编码序列分别为 信号肽DNA序列、重链可变区DNA序列、重链恒定区DNA序列、轻链可变区DNA序列和轻链 恒定区DNA序列。参见序列表，重链可变区DNA序列和轻链可变区DNA序列为SEQIDNO: 11-SEQIDNO:20,共计10条，信号肽DNA序列为SEQIDNO:21，重链恒定区DNA序列为 SEQIDNO:22,轻链恒定区DNA序列为SEQIDNO:23。
[0020] 分别根据信号肽，可变区和恒定区氨基酸序列，合成编码其氨基酸序列的三段DNA 序列，并利用重叠PCR方法，拼接为全长的重链和轻链DNA全长。将每条全长DNA序列分别 克隆至PUC18-T载体中，经测序验证正确后，获得重组克隆载体质粒；以上述重组克隆载体 质粒为模板进行聚合酶链式反应（PCR)扩增，回收PCR产物，分别得到编码免疫检查点抗体 分子的重链和轻链全长DNA片段。
[0021] 取上述相互配对的一条重链全长DNA片段与一条轻链全长DNA片段。对重链全长 DNA片段、目的载体pAAV-MCS-IRES分别进行XhoI-BglII双酶切；将酶切后的重链DNA片 段与线性目的载体配制T4连接反应体系，16°C连接过夜；然后取10yL连接反应产物转化 至Stbl3大肠杆菌感受态中，待单克隆菌落长出后，挑3-5个单克隆菌落进行摇菌扩大培 养；最后使用质粒小提试剂盒提取质粒并进行测序验证正确后获得携带重链DNA片段的重 组阳性质粒pAAV-Heavy; 对上述轻链全长DNA片段和上述重组阳性质粒pAAV-Heavy分别进行BstBI-SalI双酶 切，回收酶切产物分别得到酶切后的轻链DNA片段以及酶切载体；将酶切后的轻链DNA片 段与酶切载体配制T4连接反应体系，16°C连接过夜；然后取连接产物转化至Stbl3大肠杆 菌感受态中，待单克隆菌落长出后，挑3-5个单克隆进行摇菌扩大培养；最后使用质粒小提 试剂盒提取质粒并进行测序验证正确后获得携带重链和轻链DNA分子的腺相关病毒质粒 pAAV-IgG； 重复上述步骤，从而获得三组携带重链和轻链DNA分子的腺相关病毒质粒，分别对应 不同的免疫检查点分子。
[0022] 在无血清的FreeStyle293培养基中培养HEK293悬浮细胞，维持细胞密度为 4xl05~3x106个细胞/mL;转染前1天，调整细胞密度为1x106细胞/mL;然后离心处理收集 细胞沉淀，用培养基重悬细胞沉淀，调整细胞密度为3xl06个细胞/mL;按照终浓度为3yg/ mL的量添加上述携带重链和轻链DNA分子的腺相关病毒质粒，摇床振荡；然后按照终浓度 为9yg/mL的量添加PEI，摇床上振荡培养过夜；然后加入培养基稀释细胞，继续培养3天； 离心培养体系，收集细胞沉淀后，用PBS重悬细胞沉淀，经三次冻融后加入终浓度至5U/mL 的全能核酸酶（BenzonaseNuclease)，37°C孵育lh;最后离心处理，吸取上清，进行柱纯化 得到携带免疫检查点抗体分子编码基因的AAV病毒。
[0023] 本发明所涉及的腺相关病毒（Adreno-AssociatedVirus,AAV)是微小病毒科 (Parvoviridae)家族的成员之一。这一家族成员是一类微小、无被膜及具有二十面体结构 的病毒。病毒颗粒的直径在20~26nm之间，含有大小在4. 7kb左右的线状单链DNA基因 组。AAV是一种缺陷型病毒，它的复制和增殖依赖于辅助病毒的存在。AAV不能独立复制， 只有在辅助病毒(如腺病毒、单纯疱瘆病毒、痘苗病毒）存在时，才能进行复制和溶细胞性感 染，否则只能建立溶源性潜伏感染。在不含有辅助病毒污染的情况下，AAV血清型I-IV和 复制缺陷型重组AAV被NIH和FDA评定为生物安全级别为I级(最安全)。
[0024] 本发明的免疫增强试剂经感染到T细胞、自然杀伤细胞、细胞毒性T淋巴细胞或者 细胞因子诱导的杀伤细胞中，提高了免疫细胞的激活、增殖和分泌细胞因子的能力，即增强 免疫细胞的杀伤功能。杀伤功能增强的免疫细胞回输至人体，可以表达阻断免疫抑制信号 传递的抗体，能够进一步提高免疫效应，使得免疫细胞可以更好地识别并杀死肿瘤细胞。
[0025] 本发明的免疫增强试剂、免疫增强体系应用在体外自体或异体的过继免疫肿瘤治 疗，治疗的肿瘤类型包括血液肿瘤(例如白血病、淋巴恶性肿瘤）以及良性和恶性实体瘤； 实体瘤诸如肉瘤和癌的例子包括脂肪肉瘤、间皮瘤、尤因氏肿瘤、结肠癌、淋巴恶性肿瘤、胰 腺癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、前列腺癌、肝细胞癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、 甲状腺髓样癌、乳头状甲状腺癌、支气管癌、肾细胞癌、肝细胞瘤、胆管癌、子宫颈癌、睾丸肿 瘤、精原细胞瘤、膀胱癌、黑素瘤和CNS肿瘤。
[0026]由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有以下优点： (1)本发明首次制备携带免疫检查点抗体分子编码基因的重组腺相关病毒，用其感染 体外培养扩增的免疫细胞，使其表达免疫检查点抗体分子，从而封闭一种或一种以上的免 疫检查点介导的免疫负调控，提高了免疫细胞的激活、增殖和分泌细胞因子的能力，实现免 疫细胞的持续激活。
[0027] (2)本发明利用AAV将抗体的编码基因运输至免疫细胞，再回输至病人体内，通过 免疫细胞进行长期表达抗体，能够实现抗体进入体内后的长效性，克服了直接采用生物工 程手段获得重组抗体在体内半衰期较短的问题，大大延长了其封闭免疫检查点与相应配体 结合的作用，从而提高了免疫细胞的免疫功能，增加了对肿瘤的疗效。
[0028] (3)本发明去除野生型AAV病毒的基因，仅保留两端ITR序列，去除AAV整合至人 体染色体的特性，构建重组AAV，可以避免随机整合可能带来的抑癌基因失活和原癌基因激 活的潜在危险性，从而进一步大大提高了其安全性。
[0029] (4)本发明公开免疫增强试剂目的明确，手段高效，原料来源广泛，成本低，且便于 保存和运输，便于产业化生产和质量控制；在过继治疗过程中使用，体外即可完成，操作简 便，为过继免疫疗法取得实质性临床治疗效果提供保障。
【附图说明】
[0030] 图1为腺相关病毒质粒结构示意图； 图2为细胞因子分泌表达水平图； 图3为细胞因子分泌表达水平图； 图4为细胞因子分泌表达水平图； 图5为细胞因子分泌表达水平图； 图6为细胞周期分布图； 图7为细胞基因组DNA琼脂糖凝胶电泳图； 图8为Hoechst细胞核染色图； 图9为静脉注射本发明所述的腺相关病毒前后，小鼠肝脏和肾脏组织病理切片图。
【具体实施方式】
[0031] 下面结合实施例与附图对本发明作进一步的描述 本发明免疫增强试剂，即通过将编码免疫检查点单克隆抗体的基因序列重组到腺相关 病毒上，感染免疫细胞后，表达的抗体可以封闭免疫检查点介导的抑制信号通路，从而可以 直接阻滞这些免疫检查点引起的免疫负调控机制，有效提高免疫细胞的激活，提高免疫细 胞对肿瘤细胞的杀伤能力，具体制备过程如下。
[0032] 实施例一免疫增强试剂的构建与配制 (1)根据表1的对应关系，合成10条可编码免疫检查点单克隆抗体的重链和轻链的全 长DNA序列。重链DNA全长序列由信号肽DNA序列、重链可变区DNA序列，重链恒定区DNA 序列组成；轻链的DNA全长序列由信号肽DNA序列、轻链可变区DNA序列、轻链恒定区DNA 序列组成，具体序列参见序列表。
[0033]表1编码免疫检查点抗体分子可变区对应的氨基酸序列、核苷酸碱基序列与本 发明中构建的病毒代号
共计包括5条重链全长DNA序列和5条轻链全长DNA序列；10条DNA序列的信号肽区 序列均一致为SEQIDN0:21，对应编码氨基酸序列一致；5条重链的重链恒定区序列均一致 为SEQIDN0:22,对应的编码氨基酸序列一致；5条轻链的轻链恒定区序列均一致为SEQID N0:23,对应的编码氨基酸序列一致。信号肽区、恒定区的氨基酸序列为现有技术。
[0034] 将每条全长DNA序列分别通过合成多个有重叠区的正反向互补的单链寡聚核苷 酸（Oligo)片段，经过DNA聚合酶链式反应（PCR)拼接形成双链DNA的PCR产物片段；PCR反应条件：01ig〇片段混合物10U1，5x缓冲液10y1，IOmmoldNTPIy1，TaqDNA聚合酶 lul，加超纯水至50ul;PCR反应程序，预变性98°C，1分钟，30个循环（98°C10秒，52°C30 秒，72°C45秒)，72°C延伸5分钟后，降温至4°C;片段经凝胶电泳后利用凝胶PCR产物纯化 试剂盒纯化后，通过T4DNA连接克隆至pUCIS-T载体中，经测序验证正确后，获得携带正确 目的DNA片段的重组克隆载体质粒，可获得10个重组克隆载体质粒； 以上述重组克隆载体质粒为模板，在引物（SEQIDN0:24-SEQIDN0:27)存在下分 别进行PCR扩增，按照如下体积配制PCR反应体系：5xPCR缓冲液10yL，dNTPmix4yL， 10yM的正反向引物各IyL，重组克隆载体质粒模板50ng，Taq酶IyL，最后用超纯水补足 体积至50yL;设定如下PCR反应程序，预变性98°C，1分钟，30个循环（98°C10秒，52°C30 秒，72°C45秒)，72°C延伸5分钟后，降温至4°C。配制浓度为1%琼脂糖，将PCR反应产物进 行琼脂糖凝胶电泳，120V电泳20分钟，根据分子量标准，将重链或轻链对应