对于稳定含有蛋白质的制剂有用的组合物和方法
【专利说明】对于稳定含有蛋白质的制剂有用的组合物和方法
[0001] 本申请为2011年3月21日提交的、发明名称为"对于稳定含有蛋白质的制剂有用 的组合物和方法"的PCT申请PCT/US2011/029206的分案申请，所述PCT申请进入中国国家 阶段的日期为2012年9月24日，申请号为201180018192. 3。
[0002] 相关申请
[0003] 本申请是基于37CFR I. 53(b) (1)提交的非临时申请，基于35USC119(e)要求于 2010年3月22日提交的临时申请号61/316326的优先权，其内容通过引用整合到本文中。 发明领域
[0004] 本发明涉及非表面活性剂化合物（包括例如聚氧乙烯（POE)山梨聚糖和聚乙二醇 (PEG))用于稳定含有蛋白质的制剂和用于防止此类制剂中的蛋白质聚集的用途。
[0005] 发明背景
[0006] 当需要蛋白质制剂的稳定剂以保护蛋白质免受振荡、搅拌、剪切作用和冻融，或 在界面上的静止状态而造成的变性时，通常使用非离子去垢剂（即，表面活性剂）（参见 例如，美国专利号5, 183, 746)。作为示例的是在许多含有蛋白质的产品中聚山梨酸酯 的用途。例如，聚山梨酸酯2〇和8〇 ( Tween? 20和Tween? 80 )用于生物治疗性 产品的制剂中，用于防止表面吸附和作为抵抗蛋白质聚集的稳定剂（Kerwin, J. Pharm. Sci. 97(8) :2924-2936(2008))。聚山梨酸酯是两亲性的、非离子型表面活性剂，由聚氧乙烯 (POE)山梨聚糖的脂肪酸酯组成，聚山梨酸酯20是聚氧乙烯山梨聚糖单月桂酸酯，而聚山 梨酸酯80是聚氧乙烯山梨聚糖单油酸酯。
[0007] 然而不幸的是，聚山梨酸酯可以通过氧化或水解进行降解。当聚山梨酸酯分子降 解时，产生多种降解副产物，包括例如脂肪酸、POE山梨聚糖、PEG、PEG酯和烷基酸。聚山梨 酸酯降解的这类副产物中的某些（包括游离的脂肪酸）可以导致含有蛋白质的制剂中增加 的浊度和蛋白质聚集。因此，虽然聚山梨酸酯通常作为蛋白质稳定剂使用，但随时间从聚山 梨酸酯降解中释放的脂肪酸和其他降解副产物可以不利地影响聚山梨酸酯在含有蛋白质 的制剂中表现出的保护效果。
[0008] 因此，需要对于防止蛋白质在含有蛋白质的水性制剂中聚集的有用的额外的组合 物。
[0009] 发明概沐
[0010] 本发明基于这样的新发现，即，以某些浓度存在于水性制剂中的聚氧乙烯（POE) 山梨聚糖和聚乙二醇（PEG)对于稳定含有蛋白质或含有肽的制剂，和对于防止蛋白质在此 类制剂中的聚集是有用的。
[0011] 因此，在一个方面，本发明涉及包含抗体或其他蛋白质或肽，和POE山梨聚糖的物 质组合物。在一个实施方案中，聚氧乙稀山梨聚糖以从约20ppm至约100, OOOppm的浓度存 在。在另一个实施方案中，包含抗体或其他蛋白质或肽和POE山梨聚糖的物质组合物不含 非离子型表面活性剂，例如，不含聚山梨酸酯。任选地，物质组合物还可以不含冻干保护剂 (Iyoprotectant)，例如糖、游离氨基酸及其变体等。在某些实施方案中，物质组合物可以是 水性的或固体的形式。
[0012] 在另一个方面，本发明涉及包含抗体或其他蛋白质或肽和聚乙二醇的物质组合 物。在某些实施方案中，聚乙二醇在所述物质组合物中以低于约10, OOOppm的浓度存在，优 选在约20ppm至约10, OOOppm之间。在另一个实施方案中，物质组合物任选地包含至少一 种POE山梨聚糖，所述POE山梨聚糖任选地以从约20ppm至约100, OOOppm的浓度存在于所 述物质组合物中。物质组合物还可以任选地不含非离子型表面活性剂，例如，不含聚山梨酸 酯。任选地，物质组合物还可以不含冻干保护剂（Iyoprotectant)，例如糖、游离氨基酸及其 变体等。在某些实施方案中，物质组合物可以是水性的或固体的形式。
[0013] 在另一个方面，本发明涉及包含装有任何本文描述的物质组合物的容器的制品。
[0014] 在另一个方面，提供了用于制备含有抗体（或其他蛋白质或肽）的稳定组合物方 法，通过共同混合抗体或其他蛋白质与POE山梨聚糖或PEG。
[0015] 在另一个方面，本发明涉及增加抗体或其他蛋白质或肽在水性制剂中的稳定性的 方法，包括混合抗体或其他蛋白质或肽与起稳定作用的量的POE山梨聚糖，其中POE山梨聚 糖增加抗体或其他蛋白质或肽的稳定性。在一个实施方案中，POE山梨聚糖以从约20ppm至 约100, OOOppm的浓度存在，可任选地不含非离子型表面活性剂（例如，不含聚山梨酸酯）， 或冻干保护剂，例如糖、游离氨基酸及其变体等。
[0016] 在另一个方面，本发明涉及增加抗体或其他蛋白质或肽在水性制剂中的稳定性的 方法，包括混合抗体或其他蛋白质或肽与起稳定作用的量的聚乙二醇，其中聚乙二醇增加 抗体或其他蛋白质或肽的稳定性。在一个实施方案中，聚乙二醇以低于约10, OOOppm，优选 地在约20ppm至约10, OOOppm之间的浓度存在。在另一个实施方案中，物质组合物任选地 包含至少一种POE山梨聚糖，所述POE山梨聚糖可任选地以从约20ppm至约100, OOOppm的 浓度存在，并且可以任选地不含非离子型表面活性剂（例如，不含聚山梨酸酯），或冻干保 护剂，例如糖、游离氨基酸及其变体等。
[0017] 在另一个方面，本发明涉及防止或降低抗体或其他蛋白质或肽在水性制剂中聚集 的方法，包括混合抗体或其他蛋白质或肽与POE山梨聚糖。在一个实施方案中，POE山梨聚 糖以从约20ppm至约100, OOOppm的浓度存在。水性制剂任选地不含非离子型表面活性剂 (例如，不含聚山梨酸酯），或冻干保护剂，例如糖、游离氨基酸及其变体等。在另一个实施 方案中，抗体或其他蛋白质的聚集是由搅拌水性溶液诱导的。
[0018] 在另一个方面，本发明涉及防止或降低抗体或其他蛋白质或肽在水性制剂中聚集 的方法，包括混合抗体或其他蛋白质或肽与聚乙二醇。在一个实施方案中，聚乙二醇以低于 约10, OOOppm，优选地在约20ppm至约10, OOOppm之间的浓度存在。在另一个实施方案中， 水性制剂任选地包含至少一种POE山梨聚糖，所述POE山梨聚糖任选地以从约20ppm至约 100, OOOppm的浓度存在，并且可以任选地不含非离子型表面活性剂（例如，不含聚山梨酸 酯），或冻干保护剂，例如糖、游离氨基酸及其变体等。另一个实施方案中，抗体或其他蛋白 质的聚集是由搅拌水性溶液诱导的。
[0019] 在从重组细胞蛋白质或其他污染性蛋白质中纯化蛋白质、肽或抗体的方法中，本 发明的实施方案涉及这样的改良，所述改良包括在纯化过程中向蛋白质、肽或抗体添加 POE 山梨聚糖或聚乙二醇。
[0020] 本发明的另一个方面是通过在包含自我聚集型抗体或其他蛋白质或肽的水性溶 液中混合至少一种POE山梨聚糖或聚乙二醇，然后浓缩所述水性溶液，来制造另外的自我 聚集型抗体或其他蛋白质或肽的非聚集型水性溶液的方法。
[0021] 根据下文详细的说明和实例，本发明的其他特征和优点是显而易见的，但所述说 明和实例不应被视为限制。本申请全文引用的所有参考文献、专利和公开的专利申请的内 容都明确的通过引用整合到本文中。 附图简介
[0022] 图1显示了从抗IL13抗体与多种添加物组合的浊度分析中获得的结果，所述添加 物包括聚山梨酸酯20 (PS)、月桂酸（LA)或POE山梨聚糖20 (POE)。
[0023] 图2显示了从抗IL13抗体与多种添加物组合的蛋白质浓度分析中获得的结果，所 述添加物包括POE山梨聚糖20、PEG 1000或PEG 6000,都具有多种浓度。
[0024] 图3显示了从抗IgE抗体与多种添加物组合的蛋白质浓度分析中获得的结果，所 述添加物包括POE山梨聚糖20、PEG 1000或PEG 6000,都具有多种浓度。
[0025] 图4显示了从抗IL13抗体与多种添加物组合的浊度分析中获得的结果，所述添加 物包括POE山梨聚糖20、PEG 1000或PEG 6000,都具有多种浓度。
[0026] 图5显示了从抗IgE抗体与多种添加物组合的浊度分析中获得的结果，所述添加 物包括POE山梨聚糖20、PEG 1000或PEG 6000,都具有多种浓度。
[0027] 图6显示了从抗IL13抗体与多种添加物组合的颗粒大小分析（大于2 μ m的颗粒） 中获得的结果，所述添加物包括POE山梨聚糖20、PEG 1000或PEG 6000,都具有多种浓度。
[0028] 图7显示了从抗IgE抗体与多种添加物组合的颗粒大小分析（大于2 μ m的颗粒） 中获得的结果，所述添加物包括POE山梨聚糖20、PEG 1000或PEG 6000,都具有多种浓度。
[0029] 图8显示了从抗IL13抗体与多种添加物组合的颗粒大小分析（大于10 μπι的颗 粒）中获得的结果，所述添加物包括POE山梨聚糖20、PEG 1000或PEG 6000,都具有多种 浓度。
[0030] 图9显示了从抗IgE抗体与多种添加物组合的颗粒大小分析（大于ΙΟμπι的颗粒） 中获得的结果，所述添加物包括POE山梨聚糖20、PEG 1000或PEG 6000,都具有多种浓度。
[0031] 图10显示了从抗IL13抗体与多种添加物组合的颗粒大小分析（大于50 μπι的颗 粒）中获得的结果，所述添加物包括POE山梨聚糖20、PEG 1000或PEG 6000,都具有多种 浓度。
[0032] 图11显示了从抗IgE抗体与多种添加物组合的颗粒大小分析（大于50 μπι的颗 粒）中获得的结果，所述添加物包括POE山梨聚糖20、PEG 1000或PEG 6000,都具有多种 浓度。
[0033] 优诜实施方案的详细描沐
[0034] 通过参考下列对具体实施方案和本文囊括的实施例的详细说明，可以更容易地理 解本发明。
[0035] 除非另外定义，本文中使用的所有技术和科学术语都具有与发明所属领域的普通 技术人员通常理解的相同含义。虽然任何与本文所述相似或等价的方法和材料也可用于实 践或测试本发明，但本文描述了优选的方法和材料。本文提及的所有出版物都通过引用以 其整体整合到本文中。
[0036] 抗体和其他蛋白质的聚集主要是由疏水性相互作用导致的，最终导致变性。当部 分或完全未折叠的蛋白质的疏水区暴露在水中时，由于通常包埋着的疏水性内部现在暴露 在亲水性的水性环境中，导致热力学不利的情况。因此，来自围绕疏水区的结构性水分子的 熵减少驱使变性的蛋白质聚集，聚集主要通过已暴露的疏水区。因此，也危及了蛋白质的溶 解度。在一些情况下，蛋白质亚基可在某些条件下发生自我关联（不论是天然的或错误的 折叠），这可能导致沉淀和活性丧失。
[0037] 影响溶液中的蛋白质聚集的因素一般包括蛋白质浓度、pH、温度、其他赋形剂和机 械胁迫。在纯化、配合、生产、储藏和使用过程中，一些因素（例如，温度）比其他因素（例 如，机械胁迫）更易于控制。制剂研究将指定对pH和赋形剂的恰当选择，所述选择不诱导 聚集和/或实际上帮助防止聚集。蛋白质浓度由所需治疗剂量指定，并根据该浓度的多少 将决定是否存在更高关联状态（二聚体、四聚体等）的可能性，这可以导致溶液中的聚集。 在制剂开发过程中必须进行仔细的研究，以确定何种因素影响蛋白质聚集，以及之后可以 如何消除或控制这些因素。
[0038] 需要鉴别用于肠道外的或其他施用中的抗体或其他蛋白质的稳定溶液制品，该需 求可以导致开发用于评估多种添加物对物理稳定性的影响的测试方法。基于已知的影响蛋 白质聚集的因素和对此类应用的要求，可以使用涉及搅拌或旋转蛋白质溶液的机械方法来 评估物理稳定性。用于鉴别多种添加物防止聚集的能力的物理胁迫测试方法可以涉及暴露 于水平面上的振荡或搅拌，或者距离以n rev/min在垂直面旋转的轮轴X cm的旋转。由聚 集导致的浊度通常由视觉观察或光散射分析确定为时间的函数。备选地，可以通过HPLC测 定，将由于沉淀造成的可溶性蛋白质含量的降低定量为时间的函数。
[0039] 本发明是基于这样的新发现，即在液体制剂中存在的某些浓度的聚氧乙烯（POE) 山梨聚糖和聚乙二醇（PEG)对于稳定含有蛋白质的制剂，和用于防止此类制剂中的蛋白质 聚集是有用的。
[0040] 因此，在一个方面，本发明描述了包含不论高或低浓度的抗体或其他蛋白质以及 POE山梨聚糖的物质组合物。如本文中使用的，"聚氧乙烯山梨聚糖"或"Ρ0Ε山梨聚糖"指 具有下列化学结构的非表面活性剂化合物：
[0041π
[0042] 其中a+b+c+d优选是从约6至约80,更优选是从约8至约60,更优选是从约10至 约40,和更优选是从约10至约20。如上述，本领域技术人员应理解化合物（例如本文描述 的POE山梨聚糖）的化学合成导致化合物的一定程度的异源混合物，而非完全同源的制品。 由此可见，当本文中描述a+b+c+d是例如优选从约6至约80时，应理解所述定义是指由其 化学合成获得的异源混合物的主要组分。
[0043] POE山梨聚糖可以单个地用作抗体或其他蛋白质的稳定剂，或者可以与其他POE 山梨聚糖组合使用，用于稳定水性溶液中的抗体或其他蛋白质。在浓度范围广泛的水性溶 液中，POE山梨聚糖可用作抗体或其他蛋白质的稳定（或抗聚集）剂。在本发明的某些实施 方案中，在含有抗体或其他蛋白质的水性制剂中，POE山梨聚糖（如果用作单个稳定剂）或 POE山梨聚糖（如果组合使用）能以从约20ppm至约100, OOOppm，更优选以从IOOppm至约 50, OOOppm，更优选以从150ppm至约10, OOOppm，更优选以从200ppm至约5, OOOppm，更优选 以从200ppm至约1，OOOppm的浓度存在。
[0044] 在另一个方面，本发明描述了包含不论是高浓度或低浓度的抗体或其他蛋白质， 以及聚乙二醇的物质组合物。
[0045] 如本文中使用的，"聚乙二醇"、"PEG"及相似的术语意在涵盖聚乙二醇及其多种衍 生物，例如甲氧基-PEG-胺、二胺-PEG等。更具体而言，在本发明的某些实施方案中，术语 "聚乙二醇"或"PEG"指具有下列化学结构的非表面活性剂化合物：
[0046]
[0047] 其中η是从约5至约240,并可以任选地含有一定程度的不饱和。涵盖在本发明的 用途中的PEG可以是支化的或线性的，优选线性的。如上述，本领域技术人员应理解化合物 (例如本文描述的PEG)的化学合成导致化合物的一定程度的异源混合物，而非完全同源的 制品。由此可见，当本文中描述η优选从约5至240时，应理解所述定义是指由其化学合成 获得的异源混合物的主要组分。
[0048] PEG可