氢气在制备预防肢体缺血-再灌注损伤药物中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于医药技术领域，具体涉及氢气在制备预防肢体缺血-再灌注损伤药物 中的应用。
【背景技术】
[0002] 肢体缺血-再灌注损伤是指缺血的肢体在血流恢复时，造成比因缺血引起的还要 严重的组织损伤。肢体缺血-再灌注损伤常见于骨外科、创伤外科、血管外科等，是一临床 常见而严重的问题，其后果是通过一系列病理生理反应最终导致组织细胞的损伤乃至坏 死，甚至出现危及生命的严重并发症。尽管对缺血-再灌注损伤进行了大量研究，但其机制 至今仍不甚明了，也无十分有效的预防和治疗方法。
[0003] 近年来，氢气的生物学效应得到了广泛的研究。氢是自然界最简单的元素，氢气是 无色、无嗅、无味、具有一定还原性的双原子气体。以往大多学者一直认为氢气属于生理性 惰性气体。2007年日本学者Ohsawa等发现吸入2%氢气可成功减少脑卒中大鼠模型脑梗 死面积并改善预后，氢气被认为具有选择性抗氧化应激作用。此后众多学者用不同的动物 模型验证了氢气对各组织器官缺血-再灌注损伤的保护作用，但这些研究多集中于心、脑、 肾、肝、肠等器官，对肢体的研究相对较少。给氢的途径主要为吸入氢气、静脉或腹腔注射富 氢盐水、饮用氢水等，腹腔注射氢气的给氢途径少有研究。迄今，关于腹腔注射氢气能否预 防肢体缺血-再灌注损伤的研究尚未见报道。
【发明内容】
[0004] 鉴于此，本发明的目的在于提供氢气在制备预防肢体缺血-再灌注损伤药物中的 应用。为实现上述发明目的，提供如下技术方案： 氢气在制备预防肢体缺血-再灌注损伤药物中的应用。其中氢气纯度多99. 999%，用 氢气发生器电解水产生。氢气给予途径为腹腔注射，根据不同的动物及实验模型，用量为5 ~10mL/kg〇
[0005] 进一步，氢气在制备预防肢体缺血-再灌注引起脂质过氧化的药物中的应用。
[0006] 更进一步，所述脂质过氧化程度的判定是通过检测相关指标进行。
[0007] 再进一步，所述的相关指标是丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶（S0D)、8-异前列腺 素 F2 α (8-i S0-PGF2 α )和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px ) 〇
[0008] 本发明的有益效果在于：本发明公开了氢气在制备预防肢体缺血-再灌注损伤药 物中的应用，通过建立家兔肢体缺血-再灌注损伤模型，①检测血清MDA含量和SOD活性。 MDA和SOD是反映脂质过氧化程度的一对指标。②检测8-iS0-PGF2a水平和GSH-Px活性。 8-i So-PGF2 a为一种体内反应氧化损伤的可靠指标，被认为是测量体内氧化应激的金标准。 GSH-Px是机体内抗氧化系统中重要的抗氧化剂。
[0009] 通过上述指标的检测，证实腹腔注射氢气能减少脂质过氧化，保持氧化还原平衡， 保护组织细胞结构和功能的完整性，有效地保护肢体缺血-再灌注所造成的组织损伤。
[0010] 本发明采用以上技术方案后，与现有技术相比，具有以下优点：采用腹腔注射氢气 预防肢体缺血-再灌注损伤，方法简便、安全、副作用小、费用低，效果明显，可作为一种防 治肢体缺血-再灌注损伤的有效的新方案。
【具体实施方式】
[0011] 下面结合实施例对本发明技术方案做进一步的说明，但本发明不限于这些实施 例。
[0012] 实施例1 腹腔注射氢气对肢体缺血-再灌注损伤血清MDA和SOD活性的影响。
[0013] 实验方法：制备家兔肢体缺血-再灌注损伤动物模型，检测血清MDA含量和SOD活 性，证实腹腔注射氢气对肢体缺血-再灌注损伤的预防作用。
[0014] 具体通过以下步骤完成： 1.氢气制备：使用M177021氢气发生器(北京中西远大科技有限公司生产）电解水方 式产生氢气，纯度为99. 999%。
[0015] 2.实验动物：健康成年雄性新西兰大耳白兔30只，体质量（2. 21 ±0.13) kg。动 物购进后在SPF级动物房分笼饲养1周，饲养环境为室温25° C，湿度40%~60%。实验前12h 禁食，但正常饮水。
[0016] 3.动物分组及模型建立：30只动物随机分为三组：假手术组（Sham组)，缺血-再 灌注组（I/R组）和缺血-再灌注+腹腔注射氢气组（IRH组)，每组10只。建立兔肢体缺 血-再灌注动物模型：3〇只动物皆自耳缘静脉注射0. 20%的乌拉坦5ml/kg进行麻醉，右腹 股沟区小心剪毛，勿伤及皮肤，消毒，铺盖无菌洞巾，沿股血管神经走行方向切开皮肤，在解 剖显微镜下分离暴露股动、静脉及股神经。I/R组与IRH组动物用微血管夹夹闭股动脉，在 后肢近侧端用橡皮止血带进行环扎阻断侧枝循环，以保证右后肢血液完全断流。2h后除去 血管夹及橡皮止血带，恢复血供。Sham组动物只切开腹股沟处皮肤暴露股血管，不进行夹闭 股动脉及环扎后肢。在松开血管夹恢复血供前IOmin时，IRH组每只动物腹腔注射氢气10 mL/kg，60 s内注射完毕。其他两组每只动物分别注射等体积的空气。
[0017] 4.血样采集：在再灌注后6h，三组动物分别自股静脉抽取血液2ml，2500 r/min 离心10 min，抽取上部血清至试管，置于-20° C冰箱保存，以备检测。
[0018] 5.指标检测：MDA含量测定采用硫代巴比妥酸法，SOD活性测定采用黄嘌呤氧化 酶法，检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所，具体检测步骤按试剂盒说明书进行。
[0019] 6.统计分析：所得数据以均数土标准差(f ± 3表示，应用SPSS 16.0 for Windows统计软件包进行统计分析。多组样本均数比较行单因素方差分析（one-way AN0VA)，两两比较用Newman - Keuls检验检验），Z3〈 0. 05为有统计学意义。
[0020] 7.结果与分析：结果见表1。
[0021] 表1各组动物血清MDA、SOD测定值及比较± 3
注：表中*表示与Sham组比较KO. Ol 表示与I/R组比较K0.0 1。
[0022] 虽然缺血-再灌注损伤发病机制尚未完全阐明，但目前普遍认为其发生与氧自由 基介导的脂质过氧化密切相关。MDA和SOD是反映脂质过氧化程度的一对指标，MDA为脂质 过氧化产物的一种，测试其含量常常可反映机体内脂质过氧化的程度，间接地反映出细胞 损伤的程度。SOD对机体的氧化与抗氧化平衡起着至关重要的作用，此酶能清除超氧化物阴 离子，保护细胞免受损伤，SOD的测定可反映组织内自由基水平及脂质过氧化程度。
[0023] 从表1可见，I/R组MDA含量明显高于Sham组（尸〈0. 01) ;IRH组MDA含量明显 低于I/R组（尸〈0. 01)，接近Sham组（尸>0. 05)。I/R组与Sham组比较，SOD活性明显降 低（尸〈0· 01) ;IRH组与Sham组比较无显著降低（尸>0· 05)，其活性接近Shame组。此结果 表明，肢体缺血-再灌注损伤可使MDA含量显著升高、SOD活性显著降低。腹腔注射氢气能 使MDA含量显著降低、SOD活性显著提高。腹腔注射氢气可显著改善肢体缺血-再灌注造 成的组织损伤。
[0024] 实施例2 腹腔注射氢气对肢体缺血-再灌注损伤血清8-is〇-PGF2a水平和GSH-Px活性的影响。
[0025] 实验方法：制备家兔肢体缺血-再灌注损伤动物模型，检测血清8-iSo-PGF2a水平 和GSH-Px活性，证实腹腔注射氢气对肢体缺血-再灌注损伤的预防作用。
[0026] 1.除指标检测外，其他同实施例1。
[0027] 2.指标检测：酶联免疫吸附测定8-is〇-PGF2a水平，检测试剂盒购自Cayman Chemical公司（Ann Arbor，MI)。二硫代硝基苯甲酸法测定GSH-Px活性，检测试剂盒购自 南京建成生物工程研究所。具体检测步骤按试剂盒说明书进行。
[0028] 3.结果及分析：结果见表2。
[0029] 表2各组动物血清8-i So-PGF2。、GSH-Px测定值及比较(,:± 3
注：表中*表示与Sham组比较K0. 01 表示与I/R组比较K0. 01。
[0030] 近年研究发现，传统建立起来的检测反映脂质过氧化程度的指标如MDA和S0D，虽 然可以反映自由基水平，但这些指标易受体内外诸多因素的影响，有时不能准确反映体内 产生自由基的真实水平。最近，一种主要脂质过氧化产物一异前列腺素，可作为一种体内反 应氧化损伤的可靠指标，已为人们越来越重视。8-is〇-PGF 2a为一种主要的异前列腺素，主 要是细胞膜上的花生四烯酸在自由基的攻击下发生脂质过氧化，经非酶途径产生的，可作 为病理生理和改变细胞膜的流动性和完整性的媒介。8-is〇-PGF 2a已被证明存在运行于血 浆，从尿液排出体外，是组织中稳定的化合物，能灵敏、特异地反映再灌注后自由基增加所 引发的脂质过氧化。因此，8-is〇-PGF 2a被认为是测量体内氧化应激的金标准。GSH-Px是机 体内广泛存在的一种重要的催化过氧化氢分解的酶，它特异地催化还原型谷胱甘肽对过氧 化氢起还原反应，从而清除细胞内有害的过氧化物代谢产物，阻断脂质过氧化连锁反应，起 到保护细胞膜结构和功能完整的作用，是抗氧化系统中重要的抗氧化剂。因此，GSH-Px活 性可反映机体抗氧化能力。
[0031] 从表2可见，I/R组8-is〇-PGF2a水平明显高于Sham组（尸〈0.01)，表明肢体 缺血-再灌注损伤可致8-is〇-PGF2a明显上升。IRH组8-is〇-PGF2Jj^显低于I/R组（尸 〈0.01)，与Sham组比较无明显上升（尸〈0.01)，表明腹腔注射氢气可有效阻止由肢体缺 血-再灌注造成的8-iSo-PGF 2α的升高。I/R组GSH-Px活性较Sham组明显降低（尸〈0. 01); IRH组GSH-Px活性较I/R组明显升高（尸〈0.01)，接近Sham组（尸>0.05)。此结果表明， 肢体缺血-再灌注可损伤GSH-Px的活性，而腹腔注射氢气可明显提高GSH-Px活性，从而保 护组织细胞。
[0032] 实施例2进一步证实了腹腔注射氢气对肢体缺血-再灌注损伤的预防作用。
[0033] 以上实验结果表明，腹腔注射氢气能明显保护肢体缺血-再灌注损伤S0D、GSH-Px 活性，降低MDA、8-is〇-PGF2a的产生，减少脂质过氧化，保持氧化还原平衡，保护细胞膜的结 构和功能，有效地保护肢体缺血-再灌注所造成的组织损伤，可用于预防肢体缺血-再灌注 损伤。
【主权项】
1. 氢气在制备预防肢体缺血-再灌注损伤药物中的应用。2. 根据权利要求1所述的氢气在制备预防肢体缺血-再灌注损伤药物中的应用，其特 征在于：所述的氢气，其纯度不低于99. 999%。3. 根据权利要求1所述的氢气在制备预防肢体缺血-再灌注损伤药物中的应用，其特 征在于：氢气给予途径为腹腔注射。
【专利摘要】本发明公开了氢气在制备预防肢体缺血-再灌注损伤的药物中的应用，实验结果表明，氢气能显著降低肢体缺血-再灌注丙二醛（MDA）及8-异前列腺素F2α（8-iso-PGF2α）的升高，保护超氧化物歧化酶（SOD）及谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活性，减少脂质过氧化，保护组织细胞结构和功能的完整性，有效地保护肢体缺血-再灌注所造成的组织损伤，对临床预防和治疗肢体缺血-再灌注损伤具有重要意义。
【IPC分类】A61P9/10, A61K33/00
【公开号】CN105012339
【申请号】CN201510551053
【发明人】王岱君, 田华
【申请人】王岱君
【公开日】2015年11月4日
【申请日】2015年9月1日