一种保护和促进斑秃处毛发再生的药物及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及基因工程技术及生物药物领域，尤其涉及一种保护和促进斑秃处毛发 再生的药物及其应用。
【背景技术】
[0002] 毛发有重要的生理和社会功能，但巨大的社会竞争压力，精神持续紧张，长期熬夜 等生活方式，都会严重损害毛囊的健康进而引起脱发。流行病学调查发现：患者脱发更年轻 化，中青年成为脱发人群中的"主力军"。尽管目前对脱发的了解和认识不断增多和深入，支 持或辅助的治疗措施也有进展，临床仍然期待发现更有效、更全面的治疗方法。
[0003] 斑秃（alopecia areata)，是一种自身免疫性的非瘢痕性脱发，常发生于身体有毛 发的部位，局部皮肤正常，无自觉症状。别称圆形脱发，圆秃，鬼剃头。病因不明，毛囊、毛 球及其毛乳头均缩小，位置也上移，毛囊周围可见淋巴细胞浸润，且本病有时合并其他自身 免疫性疾病（如白癜风、特应性皮炎），故目前认为本病的发生可能存在自身免疫的发病机 制。目前对于斑秃尚无有效的治疗方法，常见的处理措施有口服糖皮质类固醇激素、环孢素 等。目前也有采用毛发移植治疗斑秃，但存在这自体毛源不足和存活效率的问题（参见文 献1 ::Thakur BK, Verma S. Is hair transplantation always successful in secondary cicatricial alopecia? Int J Trichology.2015Jan-Mar;7(l):43-4)。因此，促进斑秀 患者自身的毛发再生已成为组织修复领域亟待解决的难题之一，研究毛发再生具有重要的 理论和实际意义。
[0004] 在毛发再生的研究中，毛乳头细胞（dermal papilla cell，DPC)起到非常重要的 作用（参见文献 2:Upton JH，Hannen RF，BahtaAW, et.al. Oxidative stress-associated senescence in dermal papilla cells of men with and rogenetic alopecia.J Invest Dermatol. 2015May;135 (5): 1244-52)。斑秀患者中，DPC 功能减弱或丢失，不能 启动毛囊发育和毛发的周期性更替（参见文献3 :Norris DA, Duke R，Whang K，Middleton M. Immunologic cytotoxicity in alopecia areata:apoptosis of dermal papilla cells in alopecia areata. J Invest Dermatol. 1995May ；104(5Suppl):8S-9S. )〇
[0005] 链接粘附分子JAM-A(NM_016946)是一个跨膜分子，属于免疫球蛋白超家族。本发 明人前期实验证实，JAM-A 3' UTR可保护DPC的功能，保护毛发的生长，此研究成果已申请 中国专利，专利申请号为CN201410830811.4,发明名称为：一种维持和恢复人毛乳头细胞 原始性的方法及其应用。
[0006]目前尚无文献报道有关JAM-A基因在毛发再生的应用。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的在于提供一种保护和促进斑秃处毛发再生的药物，本发明的另一目 的在于提供JAM-A3' UTR基因促进毛发再生的方法，以及JAM-A3' UTR基因在促进局部皮肤 毛发再生中的应用。
[0008] 本发明人在预试验中证实JAM-A3'UTR上调后DPC的原始性增强，体外培养中传 代次数增加，且增强了 DPC诱导毛发再生的能力。
[0009] 而JAM-A3'UTR上调后DPC体外原始性的增加和传代次数的增加并不能保证可能 这些处理后的DPC可有效诱导斑秃处的毛发再生。这是因为在斑秃部位，皮肤及毛囊周围 的显微结构及微环境均有改变，毛囊、毛球及其毛乳头均缩小，位置也上移。周围基质明显 缩小，周围结缔组织中血管结构也发生变化（参见前述文献3)。
[0010] 那么JAM-A3' UTR究竟能否直接促进毛发再生呢？
[0011] 为了解答这些困惑，本发明构建了 JAM-A3' UTR的过表达慢病毒以更加高效稳定 地调整斑秃处皮肤组织中JAM-A3' UTR的表达，大体动物实验观察JAM-A3' UTR单独使用是 否能促进毛发再生。
[0012] 本发明选择慢病毒进行载体构建的出发点是慢病毒的感染效率较高且具有较高 的安全性（参见文献 4 :Madry H，Cucchiarini M. Clinical potential and challenges of using genetically modified cells for articular cartilage repair. Croat Med J. 2011 Jun ;52 (3) : 245-61)。慢病毒基因载体是由I型人免疫缺陷病毒改造的新型病毒载 体，作为一种高效的基因转染载体应用越来越广泛，经多次修饰改造其转导效率和安全性 都得到了保证。
[0013] 本发明的主要技术方案如下：
[0014] 首先，根据JAM-A3'UTR的基因结构，设计引物，以人表皮细胞总DNA为模板，通过 PCR调取目的片段，再构建重组人pcDNA3. 1-JAM-A3'UTR真核表达载体，在本发明的一个优 选实施例中LV11-JAM-A3'UTR的慢病毒颗粒由上海吉玛制药技术有限公司构建制备。
[0015] 然后，将LV11-JAM-A3' UTR的慢病毒颗粒定量注射至斑秃处皮肤，获得 JAM-A3' UTR高表达组小鼠。在本发明的一个优选实施例中是将5X 105的LV11-JAM-A 3'UTR慢病毒颗粒采用斑秃处皮下注射的方式移植到斑秃的C3H/HeJ小鼠。注射后每日观 察毛发再生情况。
[0016] 本发明的第一方面，提供了一种保护和促进斑秃处毛发再生的药物，该药物为提 高JAM-A 3'UTR表达量的试剂。
[0017] 所述的提高JAM-A3'UTR表达量的试剂，包括但不限于：
[0018] 1) JAM-A 3' UTR 的过表达质粒；
[0019] 2)含有JAM-A 3' UTR编码基因的重组载体；
[0020] 3)含有JAM-A 3' UTR编码基因的重组病毒；
[0021] 4)含有JAM-A 3' UTR编码基因的重组病毒载体。
[0022] 本发明的第二方面，提供了一种LV11-JAM-A 3' UTR真核表达载体（慢病毒颗粒）。
[0023] 一种LV11-JAM-A 3' UTR真核表达载体的构建方法如下：
[0024] 设计并合成引物如下：
[0025] 上游引物：
[0026] CCGCTCGAGGCCTGGTCGGCTCACCGCCTATC(SEQIDN0:1)
[0027] 下游引物：
[0028] ATAAGAATGCGGCCGCTAAAGAATTGGATATTTTTTAATGCAAATTG(SEQID NO:2)；
[0029] 以人表皮细胞总DNA为模板，PCR扩增目的片段如SEQID NO: 3所示；
[0030] 构建LV11-JAM-A3'UTR真核表达载体，选择LV11 (CMV/Neo)为载体。
[0031] 其中的真核表达载体的构建方法为常规方法，可参见工具书（著[美]J.莎姆布 鲁克，黄培堂译，《分子克隆实验指南》，科学出版社）。
[0032] 将构建好的LV11-JAM-A 3'UTR真核表达载体，经皮下注射的方式移植的方式转 染到斑秃处皮肤组织。
[0033] 本发明提供了一种含有LV11-JAM-A 3' UTR慢病毒颗粒在制备预防或治疗斑秃药 物中的应用；
[0034] 本发明也提供了一种含有LV11-JAM-A 3' UTR慢病毒颗粒在制备促进斑秃处毛发 再生的产品中的应用。
[0035] 本发明还提供了一种含有LV11-JAM-A 3' UTR的的重组病毒载体在制备复合皮肤 附属器的组织工程皮肤中的应用。
[0036] 本发明的第三方面，提供了如下1)-4)中任一所述物质在制备具有促毛发再生功 能的产品中的应用：
[0037] 1) LV11-JAM-A 3, UTR;
[0038] 2)含有LV11-JAM-A 3' UTR编码基因的重组载体；
[0039] 3)含有LV11-JAM-A 3' UTR编码基因的重组病毒；
[0040] 4)含有LV11-JAM-A 3' UTR编码基因的重组病毒载体；
[0041] 所述促生物学功能为促毛发再生；
[0042] 所述部位为斑秃处皮肤；
[0043] 所述产品为药物；
[0044] 所述LV11-JAM-A3'UTR的核苷酸序列如SEQIDN0:3所示。
[0045] 本发明的有益效果如下：
[0046] 本发明将LV11-JAM-A3' UTR慢病毒颗粒注射至斑秃处皮肤组织。LV-NC做对照。 注射后3、5、7、9、14天，观察注射后斑秃处毛发再生的情况，并记录毛发的密度、直径，注射 处皮肤取材、HE染色观察毛囊的结构变化。实验重复三次，均可发现LV11-JAM-A3' UTR可 成功诱导斑秃处毛发再生。通过实验研究发现，LV11-JAM-A3' UTR注射组较LV11-NC注射 组，毛发再生速度显著增加。HE染色结果可见LV11-JAM-A3' UTR移植组较LV-NC组毛囊数 目增多，长度增加，向下生长至皮下组织（图2)。
[0047] 本发明为实现斑秃处毛发再生以及组织工程皮肤中皮肤附属器毛发的形成提供 了新的思路和方式。
【附图说明】
[0048] 图1为斑秃模型。
[0049] 图2为LV11-JAM-A3'UTR注射后斑秃处毛发再生速度LV-NC注射组显著加快；其 中A为LV11-JAM-A3'UTR注射组，B为LV-NC注射组；箭头所指为斑秃处皮肤毛发的再生情 况。
[0050] 图3苏木精-伊红（HE)染色显示LV11-JAM-A3' UTR注射后皮肤组织中毛囊数目 增多，毛囊结构完整，可见生长期毛囊，毛囊长度增加，延伸至皮下组织；其中A1和A 2为 LV11-JAM-A3' UTR注射组，B 1和B 2为LV-NC注射组，箭头所指为新生的皮肤附属器毛囊。
【具体实施方式】
[0051] 现结合实施例和附图，对本发明作进一步描述，但本发明的实施并不仅限于此。
[0052] 实施例1 :构建慢病毒过表达质粒LV11-JAM-A3'UTR
[0053]1、制备人表皮细胞总DNA
[0054] 1)收集人的细胞至一干净的1. 5ml EP管中；
[0055] 2)加入600 y L核裂解液，用移液枪反复放以裂解组织，直到可见的组织块消失， 65。 20min;
[0056] 3)加入3 y L RNA酶，颠倒2-5次，37° 30min，然后冷却至室温。
[0057] 4)加入200 y L蛋白沉淀液并使用涡旋振荡器高速剧烈振荡20sec，转移至冰上冷 去|] 5min;
[0058] 5)室温12000rpm离心4min，形成白色致密的蛋白沉淀；
[0059] 6)小心移取上清（含DNA)至一干净的1. 5mL EP管中，加入600 y L异丙醇，移取 上清的时候勿碰到沉淀；
[0060] 7)轻轻上下颠