三角体型荧光丝素-碳点复合纳米颗粒的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于纳米材料科学和生物医学工程领域，具体涉及一种三角体型荧光丝素-碳点复合纳米颗粒的制备方法。
【背景技术】
[0002]纳米生物医学发展给人类抗癌之路带来新的机遇。纳米载体革E向递送药物或iRNA系统的研制是抗癌治疗研究的热点领域之一。利用纳米材料特殊的物理或化学性质，通过表面接枝、吸附或包裹等途径负载抗肿瘤药物，偶联不同癌症的靶标分子实现靶向递送，改变了药物在体内的分布，实现了药物在病兆区域内药物有效聚集，大幅度减少药物在体内的非特异性反应，降低了药物的毒副作用，并且有效地保护药物的活性和延长其半衰期，避免药物在发挥作用前降解。利用纳米载体自身特殊的光、热和磁特性，实现影像介导下的治疗，不仅可以实时监控治疗的效果，同时实现了一次给药，多种诊疗手段有机结合综合治疗手段，为抗癌提供一种新的方法。
[0003]纳米药物载体设计与临床应用的前提也是首要解决的问题是生物安全性和可降解性，也是制约着药物载体临床应用的主要原因之一。荧光碳量子点已经被证实具有良好的生物安全性和生物相容性，是迄今为止最有希望替代有毒的镉系量子点新型荧光纳米材料。Baker, S.N.等在德国《应用化学国际编辑》(《Angewandte Chemie Internat1nalEdit1n》，2010年49卷6726-6244页)上对碳点的制备性质等发表了综述性文章，文中指出了碳点与镉系量子点相比，具有激发光谱相似，发射光谱宽而且连续，可以从可见光驱一直延伸到红外光区、荧光稳定性高、无光闪烁，无漂白现象，其激光波长和发射波长可调控，并且可以实现一元激发多元发射，即可以实现单光子成像或双光子成像，而双光子激发的穿透力强，无光致毒和生光漂白，而且成像对比度高、深度好。Sun YP研究小组的研究成果也证实了:表面改性够的碳点有望应用于细胞和动物活体靶向物成像、活细胞、组织和动物体内PH、金属离子、DNA和蛋白质等分子的传感检测等领域(如Sun在《美国化学会》(J.Am.Chem.Soc) 2006年128卷24期，7756-7757页，发表了题为:可以发明亮多彩的量子尺寸碳点 Quantum-sized carbon dots for bright and colorful photoluminescence)。
[0004]蚕丝蛋白是一种直接从蚕丝提取出来的，无明显生理活性，无毒、无害、无免疫原性，具有良好的人体亲和性、生物相容性以及生物可降解性等特点纤维状蛋白。蚕丝蛋白被加工成人造纤维，粉末、丝素薄膜、多孔支架、水凝胶及微/纳米颗粒等，用于外科手术的缝合线、纳米药物或基因的载体、生物传感器和组织工程等方面的研究。如2010年AndreasS.L等人在《生物材料》(((B1materials)), 2010, 31, 4583-4591)上发表了题为:可控蚕丝蛋白颗粒用于药物输送(Controlling silk fibroin particle features for drugdelivery)的研究论文，他们采用盐析法制备了蚕丝蛋白纳米颗粒，考察了盐离子的浓度和PH值对纳米颗粒的形貌、尺寸和结构的影响，证实了 pH值是影响其次结构和表面电势的主要因素，并通过吸附方法把模拟药物小分子如阿尔新蓝、罗丹明B或结晶紫纳米颗粒表面，阐释通过调控PH值调控药物的释放过程。而Bano研究小组年在《综合生物学》(《Integr.B1l.，》2014年6卷203-214页)报道了题为:叶酸偶联到蚕丝蛋白纳米颗粒上靶向给药(Folate conjugated silk fibroin nanocarriers for targeted drug delivery)，他们采用叶酸偶联的丝素纳米颗粒负载阿霉素靶向肿瘤细胞，通过考察癌细胞的活性、增殖能力和胞吞作用考察纳米颗粒负载药物的治疗和缓释性能，证实了此纳米载药颗粒具有很小的免疫反应。这些研究表明了通过化学剪裁、表面改性，调控成型工艺条件制备对环境敏感的和不同孔隙度的蚕丝蛋白薄膜或颗粒，在药物或基因输送方面具有良好的应用前景。
【发明内容】
[0005]针对现有技术中的缺陷，本发明的目的是提供一种三角体型荧光丝素-碳点复合纳米颗粒的制备方法。
[0006]本发明是通过以下技术方案实现的:
[0007]本发明提供一种三角体型荧光丝素-碳点复合纳米颗粒的制备方法，所述方法包括以下步骤:
[0008]步骤一，采用氨基酸或者生物活性酶为表面活性剂合成荧光碳点；
[0009]步骤二，将天然的桑蚕茧经脱胶-丝素溶解-分离提纯，制备高纯蚕丝蛋白透明水溶液；
[0010]步骤三，在冷冻和磁力搅拌的条件下，将荧光碳点和蚕丝蛋白充分的混合，逐滴加乙醇，滴加完成后，继续搅拌，混合反应液迅速转移到冷冻冰箱内静置反应，然后取出，透析法除去未反应物，得到具有三角体型结构的荧光丝素-碳点复合纳米颗粒。
[0011]优选地，所述桑蚕苗是指家养桑蚕。
[0012]优选地，所述荧光碳点、蚕丝蛋白和水的质量比为1:5:50?1:20:100。
[0013]优选地，所述在冷冻和磁力搅拌的条件下，其中冷冻温度为O?4°C。
[0014]优选地，所述搅拌的搅拌速度在200?1000r/min。
[0015]优选地，所述搅拌的时间为30?60min。
[0016]优选地，所述混合反应液迅速转移到冷冻冰箱内静置反应，其中:冷冻冰箱温度为-18°C?_70°C，反应时间为12?72h。
[0017]优选地，所述乙醇的量为0.1%?80%。
[0018]优选地，所述氨基酸包括色氨酸、苯丙氨酸、半胱氨酸，所述生物活性酶为核糖核酸酶。
[0019]优选地，所述乙醇纯度为分析纯。
[0020]与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果:
[0021](I)本发明采用极其温和的条件，合成具有荧光特性的三角体型结构纳米颗粒，颗粒直径在80?100nm。细胞实验证实了其具有较好的生物安全性高，生物可降解。有望利用蚕丝蛋白在生物体内的可降解性能和对碳点荧光强度增强作用、PH敏感性，应用于荧光影像的指导下的药物靶向输送和控制释放药物纳米载体。
[0022](2)本发明方法制备的荧光复合纳米颗粒的量子产率高达20?40%，利用蚕丝蛋白进一步增强碳点荧光稳定性，实现细胞和活体荧光成像；
[0023](3)本发明方法制备的荧光丝素-碳点复合纳米颗粒(SF@C-dots复合纳米颗粒)，利用纳米颗粒表面的蚕丝蛋白对PH敏感性质，实现药物在特定部位的控制释放，在药物靶向运输和控制释放方面，具有广阔的应用前景；
[0024](4)本发明方法制备过程中选择了生物安全性良好的碳点和蚕丝蛋白，制备过程中无毒性物质或溶剂加入，也没有高温、高压等条件加入，可以最大限度保证药物或生物分子等活性，无环境污染，也不会生物体造成的损害；
[0025](5)本发明方法分离提纯简单，重复性好，在一般实验室均能完成，易于规模化和推广。
【附图说明】
[0026]通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显:
[0027]图1a为SFOC-dots复合纳米颗粒的低倍扫描电镜图SEM图；
[0028]图1b为SFOC-dots复合纳米颗粒的高倍扫描电镜图SEM图
[0029]图2a为SFOC-dots复合纳米颗粒的紫外吸收光谱；
[0030]图2b为SF@C-dots复合纳米颗粒的红外吸收光谱；
[0031]图3为SFOC-dots复合纳米颗粒的荧光激发光谱和发射光谱；
图4为不同浓度SF@C-dots和SF@C-dots-D0X对MGC803细胞活性的抑制作用对比图。
【具体实施方式】
[0032]下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。
[0033]实施例1
[0034]本实施例涉及一种三角体型荧光丝素-碳点复合纳米颗粒的制