链接粘附分子jam-a促进皮肤创面修复的方法及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉基因工程技术及生物药物技术领域，尤其涉及链接粘附分子JAM-A在促 进皮肤创面修复中的新用途，也即一种促进皮肤创面修复的方法，及其链接粘附分子JAM-A 在制备皮肤创面修复药物或试剂中的应用。
【背景技术】
[0002] 皮肤是人体面积最大的器官，也是机体自我更新速度最快的组织之一，它是机体 免于脱水、损伤、感染的第一道防线，是维持内环境稳定和阻止微生物、化学物质等侵入的 屏障。尽早覆盖创面，恢复皮肤的屏障功能，十分重要。常规的治疗方法采用自体皮肤或同 种异体、异种皮肤的移植和人工替代物覆盖等，由于存在着供皮来源有限，同种异体、异种 皮移植有免疫排斥反应或传染疾病的危险，人工皮肤费用昂贵等问题，常规方法难以满足 临床应用的需要（参加文献 1 :Meier TO, Guggenheim M, Vetter ST，et al.Microvascular regeneration in meshed skin transplants after severe burns.Burns.2011 ； 37 (6) : 1010-4.)。因此，促进皮肤创伤修复已成为组织修复领域亟待解决的难题之一，研究 皮肤创伤愈合修复具有重要的理论和实际意义。
[0003] 链接粘附分子JAM-A(NM_016946)是一个跨膜分子，属于免疫球蛋白超家族。 JAM-A同源二聚化后可与细胞内的roZ(PSD-95/Discs-large/Z0-l)结构域结合，和细胞迀 移、胞内外信号传递、细胞紧密连接及血管生成关系密切（参加文献2:S evers〇n EA，Lee WY, Capaldo CT, Nusrat A, Parkos CA. Junctional adhesion molecule A interacts with Afadin and PDZ_GEF2to activate Rap1A, regulate betalintegrin levels, and enhance cell migration.Molecular Biology of the Cell, 2009V〇1. 20, 1916 - 1925.)。此外， JAM-A在细胞迀移，器官发育及上皮细胞分化等方面也有重要作用（参见文献3 :Nava P, Capaldo CT, Koch S, et. al. JAM-A regulates epithelial proliferation through Akt/0 -catenin signalling. EMB0 Rep. 2011Apr ;12 (4) : 314-20)有研究者通过细胞 划痕试验证明，JAM-A可促进上皮细胞迀移（参见文献4 :PorfirioNava, Christopher T.Capaldo, Stefan Koch, KeliKolegraff, Carl Robert Rankin, AttilaE. Farkas, Mattie E. Fease, LinhengLi, Caroline Addis,CharlesA.Parkos&AsmaNusrat. JAM-A regulates epithelial proliferation through Akt/b-catenin signalling EMB0 r印orts (2011) 12, 314 - 320)〇
[0004] 目前尚无文献报道有关JAM-A基因在创面修复的应用。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供链接粘附分子JAM-A的新用途，具体是在制备皮肤创面修 复药物或试剂中的应用；本发明的另一目的在于提供一种促进皮肤创面修复的方法；本发 明的第三目的在于提供一种链接粘附分子JAM-A基因表达的载体（pGC-FU-JAM-A-GFP)及 其应用。
[0006] 本发明在前期试验中证实JAM-A上调后成纤维细胞的迀移和增殖能力增加，并且 JAM-A修饰后的间充质干细胞较对照组显著促进皮肤创面的修复。那么JAM-A能否直接促 进创面愈合？
[0007] 为了解答这些困惑，本发明进一步地构建了 JAM-A的过表达和干扰的慢病毒以更 加高效稳定地调整创面组织中JAM-A的表达，体内检测JAM-A单独使用是否能促进创面修 复。
[0008] 本发明选择慢病毒进行载体构建的出发点是慢病毒的感染效率较高且具有较高 的安全性（参见文南犬5:MadryH,CucchiariniM.Clinicalpotentialandchallenges ofusinggeneticallymodifiedcellsforarticularcartilagerepair.CroatMed J. 2011Jun;52 (3):245-61)。慢病毒基因载体是由I型人免疫缺陷病毒改造的新型病毒载 体，作为一种高效的基因转染载体应用越来越广泛，经多次修饰改造其转导效率和安全性 都得到了保证。
[0009] 本发明的第一方面，提供了链接粘附分子JAM-A的新用途，具体是在制备皮肤创 面修复药物或试剂中的应用。
[0010] 所述的药物或试剂，能够提高链接粘附分子JAM-A的表达量，包括但不限于以下 任一：
[0011] A) JAM-A及其编码基因；
[0012] B)含有JAM-A编码基因的重组载体；
[0013] C)含有JAM-A编码基因的重组病毒；
[0014] D)含有JAM-A编码基因的重组病毒载体。
[0015] 所述的链接粘附分子JAM-A(NM_016946)，其cDNA序列如SEQIDNO: 1所示。
[0016] 在本发明的一个优选实施例中，提高链接粘附分子JAM-A表达量的药物或试剂是 指重组载体 pGC-FU-JAM-A-GFP〇
[0017] 所述的皮肤创面修复，其中的"创面"是正常皮肤（组织）在外界致伤因子如外科 手术、外力、热、电流、化学物质、低温以及机体内在因素如局部血液供应障碍等作用下所导 致的损害；常伴有皮肤完整性的破坏以及一定量正常组织的丢失，同时，皮肤的正常功能受 损；也称为伤口或者创伤。创面修复也称为伤口修复、创面愈合等，是指皮肤（组织）通过 再生（Regeneration)、修复（Repair)、重建（Reconstruction)，不同程度地恢复其功能。
[0018] 本发明的第二方面，提供了一种促进皮肤创面修复的方法。
[0019] 本发明的一种促进皮肤创面修复的方法，是采用提高链接粘附分子JAM-A表达量 的药物或试剂修饰创面皮肤。
[0020] 所述的修饰，较优的，是用皮下注射的方式将提高链接粘附分子JAM-A表达量的 药物或试剂注入创面皮肤组织；
[0021] 在本发明的一个优选实施例中，是用皮下注射的方式将重组载体 pGC-FU-JAM-A-GFP移植到创周皮肤组织。
[0022] 本发明的一种促进皮肤创面修复的方法，该方法包括：构建一种JAM-A高表达的 重组载体，包括但不限于pGC-FU-JAM-A-GFP，通过皮下注射的方式移植到皮肤创面四周。
[0023] 本发明的pGC-FU-JAM-A-GFP主要感染创面皮肤中的成纤维细胞和毛囊的结缔组 织鞘的细胞。
[0024] 本发明的第三方面，提供一种链接粘附分子JAM-A基因表达的载体，并提供该载 体在制备皮肤创面修复药物或试剂中的应用。
[0025] 本发明的一种链接粘附分子JAM-A基因表达的载体，可以是一种含有JAM-A编码 基因的重组载体、一种含有JAM-A编码基因的重组病毒、一种含有JAM-A编码基因的重组病 毒载体等。
[0026] 在本发明的一个优选实施例中，所述的链接粘附分子JAM-A基因表达的载体为 pGC-FU-JAM-A-GFP〇
[0027]本发明提供了 一种重组载体pGC-FU-JAM-A-GFP，并检测了该载体促创面修复的能 力及生物安全性等。本发明还进一步提供采用PGC-FU-JAM-A-GFP促进创面修复的方法，以 及pGC-FU-JAM-A-GFP在创面修复中的应用。
[0028] 本发明基于前期JAM-A可促进细胞迀移，调节上皮细胞重排等实验依据，构建含 目的基因JAM-A慢病毒过表达载体，将其定向定量注射至创周，以便用启动表达外源性的 JAM-A，获得JAM-A高表达创面组小鼠，称之为JAM-A° v-mice。将5 X 105的pGC-FU-JAM-A -GFP慢病毒颗粒采用创周四点皮内注射的方式移植到全层皮肤缺损的小鼠，注射时间为创 伤后24小时。注射后观察并统计创面恢复情况。
[0029] 本发明提供一种JAM-A基因感染创周皮肤的方法，具体内容是根据JAM-A的基 因结构，设计一对引物，以人表皮细胞总RNA为模板，通过RT-PCR扩增，制备JAM-A cDNA， 再构建重组人peGFP-Nl-JAM-A真核表达载体，为提高转染效率，构建慢病毒过表达质粒 pGC-FU-JAM-A-GFP〇
[0030] 本发明提供了一种链接粘附分子JAM-A过表达质粒的构建方法，包括以下步骤 (即 pGC-FU-JAM-A-GFP 的构建方法）：
[0031] A、设计并合成引物P1和P2,扩增JAM-A cDNA :
[0032] PI ：CCTGAAGCTTATGGGGACAAAGGC(SEQ ID NO:2)
[0033] P2：ACCAGGATCCAACACCAGGAATGACGAGG(SEQ IDNO:3)
[0034] 以人表皮细胞总RNA为模板，通过RT-PCR扩增，制备JAM-A cDNA，序列如下：atcg cgatggggacaaaggcgcaagtcgagaggaaactgttgtgcctcttcatattggcgatcctgttgtgctccctggca ttgggcagtgttacagtgcactcttctgaacctgaagtcagaattcctgagaataatcctgtgaa