C复性30s - 72°C延伸 30s，30个循环，最后72°C聚合6min。挑选阳性克隆送Invitrogen公司进行测序鉴定。
[0075] 引物序列如下：
[0076] JAM-A-Age I-F
[0077] GAGGATCCCCGGGTACCGGTCGCCACCATGGGGACAAAGGCGCAAG(SEQ ID NO:4)
[0078] JAM-A-Age I-R
[0079] TCACCATGGTGGCGACCGGCACCAGGAATGACGAGGTC(SEQ ID NO:5)
[0080] Ubi-F
[0081] GGGTCAATATGTAATTTTCAGTG(SEQIDNO:6)
[0082] EGFP-N-R：
[0083] CGTCGCCGTCCAGCTCGACCAG(SEQIDNO:7)
[0084] 使用AgeI对获得的JAM-A过表达质粒和病毒载体进行酶切以获取线性化模板：
[0085] 酶切反应体系：
[0086]
[0087] 37°C反应2小时。
[0088] PCR产物交换进入线性化慢病毒载体制备慢病毒过表达质粒pGC-FU-JAM-A-GFP
[0089]
[0090] 于25°C反应30分钟，再于42 °C反应15分钟制备交换液，准备转化转化步骤如 下：
[0091] 用冷却的无菌吸头从每种感受态细胞悬液中各取200 y 1转移到无菌的微量离心 管中，每管加10 y 1连接液，轻轻旋转以混匀内容物，在冰中放置30分钟。将管放到预加温 到42°C的循环水浴中放好的EP管架上，恰恰放置90秒，不要摇动EP管架。快速将管转移到 冰浴中，使细胞冷却1一 2分钟。每管加800 yl LB培养基。用水浴将培养基加温至37 °C， 然后将管转移到37°C摇床上，温育45分钟使细菌复苏。将150 y 1已转化的感受态细胞转 移到AMP抗性（100ug/ml)的LB琼脂培养基上。
[0092] 将平板置于室温直至液体被吸收。倒置平皿，于37°C培养，16小时。长出的克隆 进行后续PCR鉴定。
[0093] 实施例2 :慢病毒过表达质粒pGC-FU-JAM-A-GFP感染创面皮肤
[0094] 1.全层皮肤缺损创面的制备及病毒注射
[0095] 所有的动物实验均遵守NIH实验动物要求。实验动物均为6周龄BALB/c裸鼠，雌 雄不限，重约30g，由第二军医大学实验动物中心提供。将受体动物随机分为2组，每组12 只，腹腔注射1 %戊巴比妥钠溶液，麻醉后在裸鼠脊柱旁腰背部用打孔器制成一个大小约背 部两侧制备直径为12cm的全皮缺损创面，外用凡士林纱布覆盖保护创面。
[0096] 造模后24小时后经过皮下注射移植取5 X 105的pGC-FU-JAM-A-GFP和 pGC-FU-GFP。用1微量进样器抽取病毒悬液适量注入裸鼠背部创周皮下。SPF级条件下喂 养、每日观察，移植后1，3, 5, 7,14天取材。
[0097] 2.创面恢复速度及生长因子检测
[0098] [1]创面愈合速度测定
[0099] 病毒注射后，为确定创面面积，数码相机拍照创面以及标尺，应用Image Pro Plus
[0100] 医学图像分析软件计算创面面积。所有图片拍照时选择统一的标尺、比例和 拍照模式。结果显示，pGC-FU-JAM-A-GFP注射组创面显著小于pGC-FU-GFP注射组，说 明pGC-FU-JAM-A-GFP注射组创面修复速度显著快于pGC-FU-GFP注射组。如图1所示， *P〈0. 01。
[0101] [2]冰冻切片观察注射后慢病毒的定位
[0102] 各组于病毒注射后4天创周处皮肤取材，常规冰冻切片（厚度为8微米）。用荧光 显微镜观察检测绿色荧光蛋白GFP的表达。
[0103] 结果：GFP阳性标记多见于创面周围的肉芽组织中，且pGC-FU-JAM-A-GFP注射组 荧光呈点状分布，复合JAM-A的表达特点。这些结果表示带有GFP示踪的病毒颗粒迀移到 创周的组织细胞中。如图2所示。
[0104] 3. western-blot检测创周组织促创面修复相关因子（bFGF，TGF- 0和EGF)中的表 达
[0105] [1].收集创伤后5天即慢病毒颗粒注射后4天的创周标本，均为创周0. 5cm，置于 5mL的收集管加，按比例加入适量组织+适量的裂解液+相应的蛋白酶抑制剂（protease inhibitor)，电动勾衆机勾衆；
[0106] [2].匀浆完毕后冰上孵育40min，这段时间内间隔用枪头吹打匀浆液，保证裂解 液与组织充分接触、裂解；
[0107] [3]. 4°C、13000 转、离心 30 ~40min;
[0108] [4].取上清即为原始的总蛋白样本。
[0109] [5]. -部分蛋白（10ul)用于测定蛋白浓度，BCA法多用。
[0110] [6].另外一部分蛋白加入上样缓冲液，KKTC变性5min，待样品恢复到室温后准 备上样。
[0111] [7].配胶、电泳、转膜。
[0112] [8].将已有蛋白样品的PVDF膜浸没于5% BSA封闭液中室温缓慢摇荡一小时。一 抗室温下轻摇孵育一小时。
[0113] [9].根据一抗来源选择合适的二抗，根据鉴定方法选择辣根过氧化物酶HRP标记 的抗体，按相应比例稀释（1:1000~1:10000)，室温轻摇一小时。
[0114] [ 10].洗涤，使用辣根过氧化物酶HRP-ECL发光法。
[0115]结果可见，和 pGC-FU-GFP 注射组相比，GC-FU-JAM-A-GFP 注射组 bFGF，TGF- 0 和 EGF的表达量显著增加。如图3所示。
[0116] 4) H-E染色观察创面新生皮肤的显微结构
[0117] 于移植后14天取材，取各组创面中心直径1.5cm范围皮肤，4%多聚甲醛固定24 小时，石蜡包埋，连续切片，切片厚度为5 y m。对创面皮肤切片行H-E染色，显微镜下观察发 现：14天后，各组创面均已覆盖，但注射pGC-FU-JAM-A-GFP的新生皮肤有大量皮钉和新生 皮肤附属器出现，PGC-FU-GFP注射组无附属器出现。如图4所示。
[0118] 以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述 实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可作出种种的等同的 变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。
【主权项】
1. 链接粘附分子JAM-A在制备皮肤创面修复药物或试剂中的应用。2. 根据权利要求1所述的链接粘附分子JAM-A在制备皮肤创面修复药物或试剂中的应 用，其特征在于，所述的药物或试剂为提高链接粘附分子JAM-A的表达量的药物或试剂。3. 根据权利要求2所述的链接粘附分子JAM-A在制备皮肤创面修复药物或试剂中的应 用，其特征在于，所述的药物或试剂包含以下任一： A) JAM-A及其编码基因； B) 含有JAM-A编码基因的重组载体； C) 含有JAM-A编码基因的重组病毒； D) 含有JAM-A编码基因的重组病毒载体。4. 根据权利要求2所述的链接粘附分子JAM-A在制备皮肤创面修复药物或试剂中的应 用，其特征在于，所述的药物或试剂包含重组载体pGC-FU-JAM-A-GFP。5. -种促进皮肤创面修复的方法，其特征在于，该方法是采用提高链接粘附分子 JAM-A表达量的药物或试剂修饰创面皮肤。6. 根据权利要求5所述的一种促进皮肤创面修复的方法，其特征在于，所述的修饰是 用皮下注射的方式将提高链接粘附分子JAM-A表达量的药物或试剂注入创面皮肤组织。7. 根据权利要求5所述的一种促进皮肤创面修复的方法，其特征在于，所述的修饰是 用皮下注射的方式将重组载体pGC-FU-JAM-A-GFP移植到创周皮肤组织。8. -种链接粘附分子JAM-A基因表达的载体在制备皮肤创面修复药物或试剂中的应 用。9. 根据权利要求8所述的一种链接粘附分子JAM-A基因表达的载体在制备皮肤创面修 复药物或试剂中的应用，其特征在于，所述的一种链接粘附分子JAM-A基因表达的载体是 pGC-FU-JAM-A-GFP〇10. 根据权利要求9所述的一种链接粘附分子JAM-A基因表达的载体在制备皮肤创面 修复药物或试剂中的应用，其特征在于，所述的应用包括以下步骤： A、 设计并合成引物Pl和P2,扩增JAM-A cDNA : Pl ：CCTGAAGCTTATGGGGACAAAGGC(SEQ ID NO:2) P2 ：ACCAGGATCCAACACCAGGAATGACGAGG(SEQ ID NO :3) 以人表皮细胞总RNA为模板，通过RT-PCR扩增，制备JAM-A cDNA，序列如SEQ ID NO: I 所示； B、 构建慢病毒过表达质粒pGC-FU-JAM-A-GFP ; C、 将步骤B得到的pGC-FU-JAM-A-GFP通过皮下注射的方式移植到创面四周。
【专利摘要】本发明涉及基因工程技术及生物药物技术领域，具体涉及链接粘附分子JAM-A促进皮肤创面修复的方法及其应用。本发明提供了链接粘附分子JAM-A的新用途，即在制备皮肤创面修复药物或试剂中的应用。本发明还提供了一种促进皮肤创面修复的方法，及其一种链接粘附分子JAM-A基因表达的载体pGC-FU-JAM-A-GFP慢病毒颗粒在制备皮肤创面修复药物或试剂中的应用。
【IPC分类】A61P17/02, A61K35/76, A61K48/00, A61K39/395
【公开号】CN105012951
【申请号】CN201510367008
【发明人】仵敏娟, 夏照帆, 刘厚奇, 纪世召, 郑勇军, 肖仕初, 房贺
【申请人】中国人民解放军第二军医大学
【公开日】2015年11月4日
【申请日】2015年6月29日