gttgtcctgtgc ctactcgggcttttcttctccccgtgtggagtggaagtttgaccaaggagacaccaccagactcgtttgctataata acaagatcacagcttcctatgaggaccgggtgaccttcttgccaactggtatcaccttcaagtccgtgacacgggaa gacactgggacatacacttgtatggtctctgaggaaggcggcaacagctatggggaggtcaaggtcaagctcatcgt gcttgtgcctccatccaagcctacagttaacatcccctcctctgccaccattgggaaccgggcagtgctgacatgct cagaacaagatggttccccaccttctgaatacacctggttcaaagatgggatagtgatgcctacgaatcccaaaagc acccgtgccttcagcaactcttcctatgtcctgaatcccacaacaggagagctggtctttgatcccctgtcagcctc tgatactggagaatacagctgtgaggcacggaatgggtatgggacacccatgacttcaaatgctgtgcgcatggaag ctgtggagcggaatgtgggggtcatcgtggcagccgtccttgtaaccctgattctcctgggaatcttggtttttggc atctggtttgcctatagccgaggccactttgacagaacaaagaaagggacttcgagtaagaaggtgatttacagcca gcctagtgcccgaagtgaaggagaattcaaacagacctcgtcattcctggtgtgag(SEQ ID NO:1)〇
[0035] B、构建慢病毒过表达质粒pGC-FU-JAM-A-GFP。
[0036] 步骤B中，所用载体为pGC-FU-GFP，构建方法为本领域常规技术，参见马文丽著， 《分子生物学实验手册》，人民军医出版社。
[0037] 进一步地，本发明提供了上述的一种链接粘附分子JAM-A基因表达的载体在制备 皮肤创面修复药物或试剂中的应用。
[0038] 在本发明的一个优选实施例中，提供了 pGC-FU-JAM-A-GFP慢病毒颗粒在在制备 皮肤创面修复药物或试剂中的应用。
[0039] 所述的应用，具体地，将5 X 105的pGC-FU-JAM-A-GFP通过皮下注射的方式移植到 创面四周。pGC-FU-JAM-A-GFP主要感染创周皮肤中的成纤维细胞和毛囊的结缔组织鞘的细 胞并促进创面修复相关因子的分泌，进而促进创面的修复。
[0040] 通过实验研究发现，pGC-FU-JAM-A-GFP注射组较pGC-FU-GFP注射组，创面修复速 度显著增加（图1)。
[0041] 根据GFP蛋白在创周皮肤成纤维细胞和毛囊结缔组织鞘中的定位可推断病毒主 要感染创周的毛囊结缔组织鞘中的细胞和成纤维细胞（图2)。
[0042]western-blot 结果显示 pGC-FU-JAM-A-GFP 注射组创周皮肤中 TGF-0、bFGF 和 EGF的表达量较pGC-FU-GFP注射组显著增加（图3)。
[0043] 创面完全恢复后，苏木精-伊红（H-E)染色的结果发现pGC-FU-JAM-A-GFP注射组 的皮肤细微结构，与pGC-FU-GFP注射组相比，表现在可见较多的毛囊等附属器（图4)。
[0044] 本发明实验证明，JAM-A可以促进创面TGF-f3、bFGF和EGF的表达，显著提高创面 的修复速度，且促进新生创面附属器的形成。此说明，JAM-A与促进皮肤创面修复有关。本 发明为皮肤创面快速修复以及组织工程皮肤中皮肤附属器的形成提供了新的思路和方式。
【附图说明】
[0045] 图1为JAM-A过表达慢病毒pGC-FU-JAM-A-GFP注射后皮肤创面修复速度较空载 体注射组显著加快。
[0046] 图2为检测慢病毒感染后在小鼠创面周边皮肤组织中的定位，其中A pGC-FU-JAM-A-GFP注射组，B pGC-FU-GFP注射组，箭头所指为病毒感染组织细胞后翻译的 绿色荧光蛋白。
[0047]图 3 为 western-blot 检测 pGC-FU-JAM-A-GFP 注射后创面皮肤中的 TGF- 0、bFGF 和EGF的表达量较pGC-FU-GFP注射组显著增加。
[0048] 图4苏木精-伊红（HE)染色显示pGC-FU-JAM-A-GFP注射后皮肤超微结构的改变， 结果显示pGC-FU-JAM-A-GFP注射组较pGC-FU-GFP注射组有更多的皮肤附属器出现，其中 A pGC-FU-JAM-A-GFP注射组，B pGC-FU-GFP注射组，箭头所指为新生的皮肤附属器毛囊。
【具体实施方式】
[0049] 现结合实施例和附图，对本发明作详细描述，但本发明的实施不仅限于此。
[0050] 本发明所用试剂和原料均市售可得或可按文献方法制备。下列实施例中未注明 具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人《分子克隆：实验室指南》（New York :Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照常规条件，或 按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
[0051] 实施例1:构建慢病毒过表达质粒pGC-FU-JAM-A-GFP
[0052] 1、制备人表皮细胞总RNA
[0053] 成人体皮来自长海医院整形外科。原代培养得到表皮细胞。用上海华舜生物工程 有限公司总RNA抽提试剂盒，按常规的异硫氰酸胍法提取获得总RNA。方法如下：
[0054] 取一皿直径3. 5cm的培养皿的单层生长的表皮细胞，直接弃去培养基，加入1ml 的TRIzol溶解细胞，细胞充分溶解后，用移液管将细胞裂解物移出。将细胞裂解样品在 15~30°C条件下孵育5分钟，使核蛋白体完全分解。每lml TRIzol加0.2ml氯仿，盖紧 样品管盖后用手摇晃试管15秒并在30°C下孵育2~3分钟。在2~8°C条件下以不超 过12, 000Xg的离心力冷冻离心15分钟。离心后的混合物可分成三层：下层为红色的苯 酚-氯仿层，中间层和上层无色的水样层。RNA存在于上层水样层当中，其容量大约为所加 TRIzol容量的60%。将水样层转移到一用DEPC处理过的，无RNase的试管中，通过跟异丙 醇混合来沉淀RNA。每lml TRIzol加入0. 5ml异丙醇。将混合的样品在15~30°C条件下 孵育10分钟然后在2~8°C条件下以不超过12, 000Xg的离心力高速冷冻离心10分钟。 RNA沉淀在离心后可以形成一胶状片状沉淀附着于试管壁和管底。用75%的乙醇（用DEPC 处理过的超纯水进行配制）洗涤RNA沉淀一次，每lml的TRIzol至少加入lml的75%乙 醇。旋涡振荡混合样品并在2~8°C条件下以不超过7, 500Xg的离心力高速冷冻离心5 分钟。空气干燥5~10分钟RNA沉淀。不能让RNA沉淀完全干燥，会降低它的可溶性。用 DEPC处理过的超纯水溶解RNA样品。
[0055] 2、合成引物及构建peGFP-Nl-JAM-A真核表达载体
[0056] [1] ?设计引物
[0057]上游引物：CCTGjAAGCTT丨ATGGGGACAAAGGC(SEQ IDNO:2)
[0058] HindIII
[0059]下游引物：ACCAjGGATCC^AACACCAGGAATGACGAGG(SEQ IDNO:3)
[0060] BamHI
[0061] 酶切位点为HindIII和BamHI，分别加入引物的5'端，并加入酶切位点的保护碱 基。
[0062] [2] ? RT-PCR扩增目的片段
[0063]
[0064] 以逆转录得到的cDNA为模板，钓取目的基因片段。方法如下：
[0065]
[0066]
[0067]取5 y 1PCR产物，做1 %琼脂糖凝胶电泳（含EB 0. 5 y g/ml;电压：80V)鉴定；其 余用于回收、纯化目的片段。
[0068] [3] ?回收纯化目的片段
[0069] 45 y 1 PCR产物经1 %琼脂糖凝胶电泳（含EB 0? 5 y g/ml;电压：50V)分离出目 的条带，在紫外灯上切下含目的条带的凝胶，用中科英达3S DNA Gel Purification Kit回 收、纯化目的片段，操作方法见说明书，最后用50 y 1 ddH20溶解目的DNA。取5 y 1做1 % 琼脂糖凝胶电泳（含EB 0. 5μg/ml ;电压：80V)鉴定；其余放-20°C保存。电泳见片段大小 符合要求，准备酶切、连接。
[0070] [4] ?重组质粒的鉴定及保存
[0071] 分别回收、纯化经Hindlll和BamHI双酶切后的载体片段和目的片段。所得DNA 各自溶于30 y 1 ddH20中，1%琼脂糖凝胶电泳（含EB 0. 5 y g/ml ;电压：80V)鉴定，-20°C 保存。
[0072] 用T4DNA连接酶重组连接酶切后的载体片段和目的片段，形成pEGFP-JAM-A重组 质粒。用上述重组质粒转化感受态大肠杆菌DH5 a，扩增细菌并测序。
[0073] 3、慢病毒过表达质粒pGC-FU-JAM-A-GFP
[0074]设计引物采用PCR方法从JAM-A真核表达载体中钓取目的基因，方法如下： 反应体系：Primer (+) 0? 4 y L，Primer (-) 0? 4 y L，10 X 缓冲液 2. 0 y L，MgC120. 5 y L， dNTPs(2. 5mmol/L)0. 8yL，Taq多聚酶0. 2yL，质粒1 yL(阴性对照组不加），由ddH20配 置为20 y L。PCR反应条件：94°C热启动30s - 94°C变性30s - 60°