狂犬病病毒的纯化方法

狂犬病病毒的纯化方法
【专利说明】狂犬病病毒的纯化方法
[0001] 本申请是以下申请的分案申请：申请日2010年4月8日，申请号201080004678. 7， 发明名称"狂犬病病毒的纯化方法"。
[0002] 本发明的目的是一种纯化从细胞培养物得到的狂犬病病毒的方法。
[0003] 通常，从经感染的细胞培养物得到的病毒收获物不仅含有所希望的病毒，而且还 含有细胞的蛋白质和DNA，其是应当除去的杂质。因为病毒负责大量的细胞裂解和/或病毒 收获物很晚才取得，所以盐析的细胞蛋白质和DNA的量就更加大。除了细胞级的杂质外，其 中存在经感染细胞的培养基的蛋白质也是在施行该病毒纯化方法时力图去除的杂质。
[0004] 在病毒用于疫苗生产时，力图得到尽可能纯的制剂，以避免针对蛋白质杂质的过 敏反应的发展。在一些国家，存在这样的法律，其限定在含有从连续细胞系得到的产物的疫 苗中100pg/疫苗剂量，甚至更低的所准许的最大细胞DNA量。
[0005] 在现有技术中已经描述过纯化狂犬病病毒的不同方法。
[0006] US 4 664 912描述了在用0-丙醇酸内酯使其失活后通过区带离心法纯化狂犬 病病毒的方法。另一种方法在于，当待纯化的病毒收集物的体积很大时联用体积排阻色谱 法与阴离子交换色谱法。
[0007] US4 725 547描述了通过在硫酸cellulofine(硫酸和纤维素的酯）上的亲和层 析法来纯化狂犬病病毒的方法。
[0008] W0 97/06243描述了纯化病毒，特别是纯化来自经感染的Vero细胞的培养物的狂 犬病病毒的方法。该方法包括阴离子交换色谱，接着是阳离子交换色谱，最后通过金属螯合 亲和色谱完成。在使用这种方法时，通过使用所谓的"总DNA临界值测定"技术，在一个剂 量的疫苗中所含的残留DNA的含量< 30-40pg。
[0009] Kumar A. P等人在Microbes and Infection (2005)，7,第 1110-1116 页中对从经感 染的Vero细胞的培养物的上清液纯化狂犬病病毒的两种方法进行了比较，所述经感染的 Vero细胞在含有胎牛血清的培养基中进行培养。它显示，基于阴离子交换色谱柱（DEAE-琼 脂糖CL -6B)的纯化方法表现优于蔗糖梯度区带离心纯化方法，因为在就残留核酸和蛋白 质的量而言可比较的纯度等级下，用该色谱方法，狂犬病病毒的得率更好。
[0010] Frazatti-GallinaN.M?在"Vaccine"（2004)，23,第 511-517 页中也描述了一种 从在无胎牛血清培养基中培养的经感染的Vero细胞的培养物的上清液中纯化狂犬病病毒 的方法。该纯化方法在病毒收获物的澄清和浓缩步骤后还采用了在DEAE-纤维素基担体 上的阴离子交换色谱法步骤。采用这种方法时，采用印迹杂交技术测量的残留DNA的量为 <23pg/疫苗剂量。
[0011] 因此，当该狂犬病病毒纯化方法包括离子交换色谱法步骤时，几乎总是看到一个 阴离子交换色谱法步骤，为的是将含有待纯化病毒的培养基中的核酸保留在这种色谱担体 上。
[0012] -种表现特别好的病毒纯化方法应该能够以最佳方式除去细胞的蛋白质和DNA 杂质，同时保证所纯化狂犬病病毒的最大得率，并且始终存在寻找符合这些标准的新方法 的需要。
[0013] 本发明的目的是提供一种符合这些标准的新的纯化方法。
[0014] 本发明的另一个目的是提供一种用于从无动物血清或任何血清蛋白质的病毒收 获物纯化狂犬病病毒的方法，更特别地，是提供一种其中仅使用非动物来源产品的纯化方 法。
[0015] 为此，本发明的目的是： 一种狂犬病病毒的纯化方法，它包括唯一的离子交换色谱法步骤，所述步骤是阳离子 交换色谱法步骤，根据该步骤： a. 让被病毒感染的细胞的培养物的上清液（surnageant)与阳离子交换色谱担体接 触，该担体含有在其上已通过共价键接枝磺基异丁基基团的聚甲基丙烯酸酯基体，以便这 种狂犬病病毒结合在担体上，并在第二步中， b. 从其担体上洗脱病毒。
[0016] 根据本发明方法的一个方面，被狂犬病病毒感染的细胞的培养物的上清液没有动 物血清或任何血清蛋白质。
[0017] 根据另一个方面，被狂犬病病毒感染的细胞的培养物的上清液没有任何动物来源 的外源蛋白质。
[0018] 根据另外一个方面，在被狂犬病病毒感染的细胞的培养物的上清液中非动物来源 的外源蛋白质的浓度彡15mg/l。
[0019] 根据另外一个方面，被狂犬病病毒感染的细胞的培养物的上清液没有任何动物来 源的外源产品。
[0020] 依照根据本发明的方法的一个实施方案，在与阳离子交换色谱担体进行接触之 前，预先使被狂犬病病毒感染的细胞的培养物的上清液澄清。
[0021] 根据本发明的纯化方法的特征在于，在洗脱液中测得的病毒量对应于在已与该色 谱担体接触的上清液中测得的病毒量的至少70%。
[0022] 更特别地，根据本发明的纯化方法的特征在于，在洗脱液中测得的总蛋白质量对 应于在已与该色谱担体接触的上清液中测得的总蛋白质量的40%以下，并且在该洗脱液中 测得的DNA量对应于在已与该色谱担体接触的上清液中测得的DNA量的5%以下，优选地 2. 5%以下，更加优选地1%以下。
[0023] 依照根据本发明的方法的另一个实施方案，在从其色谱担体洗脱该病毒之后，任 选地对其进行浓缩，然后用核酸酶进行处理。
[0024] 根据本发明方法的一个方面，该核酸酶是核酸内切酶，例如benzonase。
[0025] 在本发明的另一个实施方案中，随后对该洗脱液进行蔗糖梯度超离心，并且收集 含有纯化病毒的梯度级分。
[0026] 在本发明的另一个方面中，随后用病毒灭活剂灭活该纯化的狂犬病病毒。
[0027] 在另一个特别的方面中，所述病毒灭活剂是P_丙醇酸内酯。
[0028] 根据一个优选的方面，根据本发明方法的所有步骤都是用非动物来源产品来进行 的。
[0029] 本发明的目的还在于一种抗狂犬病疫苗的生产方法，其中： a) 用狂犬病病毒感染细胞培养物， b) 根据本发明的方法，从经感染细胞的培养物的上清液开始来纯化狂犬病病毒， C)让在b)中得到的纯化病毒的悬浮液在储存缓冲液中进行混合，以及 d)把在c)中得到的混合物以单剂量或多剂量疫苗剂型进行分配。
[0030] 根据另一个方面，本发明涉及一种抗狂犬病疫苗的生产方法，其中： a) 用狂犬病病毒感染细胞培养物， b) 根据本发明的方法，从经感染细胞的培养物的上清液纯化狂犬病病毒， c) 让在b)中得到的经纯化病毒的悬浮液在冻干缓冲液中进行混合， d) 把在c)中得到的经纯化病毒的悬浮液以单剂量或多剂量疫苗剂型进行分配，以及 e) 对这些疫苗剂进行冻干。
[0031] 最后，本发明的目的在于含有纯化的并灭活的狂犬病病毒的疫苗，其特征在于，存 在于有效剂量（根据NIH检测，在含有2. 5UI的疫苗剂量中）疫苗中的用定量PCR测定的残 留DNA的量与用Bradford法测定的总蛋白质的量分别小于20pg与40呢，优选地小于10pg 与20吨。
[0032] 根据另一个方面，包含在有效剂量疫苗中的总蛋白质的至少70%是狂犬病病毒的 蛋白质。
[0033] 最后，优选地，根据本发明的疫苗没有任何动物来源的外源产品。
[0034] 发明详沐 本发明的狂犬病病毒纯化方法包括唯一的离子交换色谱法步骤，所述色谱法步骤是阳 离子交换色谱法步骤。当然，在本发明的范围内，该狂犬病病毒的纯化方法不限于唯一的色 谱法步骤，而可以包括一个或多个其它额外步骤，在这些步骤不是离子交换色谱法步骤的 情况下。与现有技术所考虑的不同，本发明人已证明，其担体含有在其上已通过共价键接枝 磺基异丁基基团的聚甲基丙烯酸酯基体的阳离子交换色谱的性能优于阴离子交换色谱的 性能。不受理论的约束，看来这种狂犬病病毒具有正的和负的双重极性，这允许其同时结合 在阴离子交换剂担体（DEAE型）和阳离子交换剂担体（S0 3型）上。相对于在色谱担体的 负载量限度内与该色谱担体接触的病毒和DNA的起始量，基于该洗脱液中测得的狂犬病病 毒和DNA的量来计算在本发明的范围内的"色谱法性能"。对于相等量的已与该色谱担体接 触的病毒和DNA，在洗脱液中测得的病毒的量越大，并且残留DNA的量越低，则色谱担体的 性能越好。借助有利于该狂犬病病毒与阳离子交换剂相互作用的柔软聚合物链，将磺基异 丁基基团接枝在聚甲基丙烯酸酯基体上。优选地，该聚合物链包括具有下式的单体单元链 段：
这些聚合物链是在也能使与聚甲基丙烯酸酯基体接枝的铈基催化剂存在下，通过具有 化学式CH2=CH-C0-NH-C(CH3)2-CH2-S0 3-的单体的聚合得到的。它们平均含有15-25个单 体单元。这种色谱担体通常呈微粒状，其尺寸一般在20-100Mm，优选地在40-90Mm之间变 化。具体地，这种类型的担体尤其是由MERCK公司以名称Fractogel ? EMD S03进行销售 的。这种类型的担体装在色谱柱中，其长度与直径是根据待纯化的收获物的体积进行选择 的。实施例1列出的结果表明，在所有已测试的阴离子与阳离子交换剂色谱担体中只有用 Fractogel ?EMD S03担体才得到良好的性能。用所有其它所测试的强阳离子交换剂色谱担 体得到的病毒得率非常低（在洗脱液中回收到少于10%的所引入的病毒）。用阴离子交换 剂色谱担体得到的病毒得率较好（40-70%)，然而仍然低于用Fractogel B EMD S03担体得 到的病毒得率，后者一般高于70%，往往高于80%。另外，用阴离子交换剂色谱担体除去较少 的DNA。令人惊奇地，仅含有在其上已通过共价键接枝磺基异丁基基团（它们起着配体的作 用）的聚甲基丙烯酸酯基体的阳离子交换剂色谱担体，允许以良好的性能从经狂犬病病毒 感染的细胞的培养物的上清液纯化病毒。在一个色谱法步骤中同时除去多于60%的总蛋白 质，至少2. 5个log1Q DNA，优选地至少3. 0个log1Q DNA，更优选地至少3. 5个log1Q DNA (这 对应于除去多于99%的细胞DNA)，同时保持至少70%的狂犬病病毒得率（即在该洗脱液中 测得的狂犬病病毒量，它至少对应于初始与该色谱担体接触的狂犬病病毒量的70%)，和优 选地至少80%。尤其当被狂犬病病毒感染的细胞培养物的上清液不含有动物血清或血清蛋 白质（如白蛋白）时，观察到这些性能。因此，在其色谱洗脱液中测得的总蛋白质量和DNA 的量分别含有少于总蛋白质量（其与该色谱担体接触的用狂犬病病毒进行感染的细胞的 培养物的上清液体积中存在的总蛋白质量）的40%和少于DNA量（已与该色谱担体接触的 用