一种交联型聚乙烯亚胺作为肿瘤蛋白抗原疫苗载体的用图
【技术领域】
[0001]本发明涉及分子药剂学技术领域中的肿瘤免疫治疗方向，具体涉及一种交联型聚乙烯亚胺作为蛋白抗原疫苗载体的用途。
【背景技术】
[0002]肿瘤疫苗是目前肿瘤免疫治疗的重要手段。肿瘤疫苗是通过激活自身免疫系统，增强免疫系统对肿瘤抗原的识别能力，改善免疫微环境，诱导机体的特异性细胞免疫和体液免疫反应，从而阻止肿瘤的生长、扩散和复发，最终清除或控制肿瘤。研究开发出安全性好且能够有效刺激机体细胞免疫和体液免疫的疫苗及其载体和佐剂是绝大多数疫苗研发中的关键问题。
[0003]肿瘤抗原疫苗的作用机理是采用肿瘤的抗原激活免疫系统，产生特异性细胞免疫，实现抗肿瘤效果。目前，肿瘤抗原疫苗研究的重点是控制抗原在抗原提呈细胞内部的处理过程和其通过MHCI途径进行抗原提呈激活细胞毒性T淋巴细胞，从而产生强大的抗肿瘤效果。
[0004]聚合物纳米材料由于其良好的生物安全性和生物可降解性且可保护抗原免受降解等优势而在疫苗载体的研究过程中备受关注。PEI是其重的研究热点，大量的报道证明PEI25KDa是良好的基因载体，但是由于毒性大，限制了它的应用。
[0005]利用抗原蛋白在一定条件下带负电的特点，陈剑等人设计了疏水修饰型PEI的新型抗原载体输送系统，带负电的蛋白质和带正电的疏水修饰型PEI以静电作用结合形成纳米粒(参见中国专利CN103059295A)，研究表明，疏水修饰型PEI为基础制备的纳米粒子可以有效提高抗原交叉提呈反应并降低细胞毒性，具有成为治疗性肿瘤疫苗的纳米载体系统的潜力。但疏水性的PEI在体内无法降解，对其进一步的应用具有一定的限制。
【发明内容】
[0006]针对现有技术中的缺陷，本发明的目的是提供一种交联型聚乙烯亚胺作为肿瘤蛋白抗原载体的应用。
[0007]本发明是通过以下技术方案实现的:
[0008]本发明提供一种交联型聚乙烯亚胺作为肿瘤蛋白抗原载体的应用。本发明所使用的可降解聚乙稀亚胺的合成参照文献(M.A.Gosselin, ff.Guo, and R.J.Lee, “Efficientgene transfer using reversibly cross-1 inked low molecular weightpolyethylenimine,，，B1conjugate Chemistry, vol.12, n0.6, pp.989 - 994, 2001.)。所使用的交联剂DTBP中含有二硫键，因此形成的可降解PEI中含有氧化还原敏感型的二硫键。谷胱甘肽是体内重要的还原剂，细胞质中谷胱甘肽的含量为(0.5-10)mM，远远高于细胞外的的含量(2-20) μΜ，因而，含有二硫键的可降解PEI在细胞质中容易被降解从而降低PEI的毒性。
[0009]可降解的聚合物高分子作为抗原疫苗载体的另一个优点是复合物纳米粒子制备简单，并且本发明中的采用的聚合物高分子和蛋白抗原具有较强的结合力，可以携带抗原蛋白被抗原提呈细胞识别；最后，本发明中采用的聚合物高分子能够显著降低细胞毒性，是一种优良的载体材料。
[0010]作为优选方案，所述肿瘤蛋白为带负电荷的蛋白质。
[0011]作为优选方案，是将所述交联型聚乙烯亚胺与肿瘤蛋白抗原制备成复合纳米粒子。
[0012]作为优选方案，所述复合纳米粒子的制备方法具体包括如下步骤:
[0013]将交联型聚乙烯亚胺和肿瘤蛋白抗原分别配制成交联型聚乙烯亚胺溶液和肿瘤蛋白抗原溶液；
[0014]将所述聚乙烯亚胺溶液和肿瘤蛋白抗原溶液混合后，通过漩涡、搅拌或振荡的方法混合均匀后，得到复合纳米粒子。
[0015]作为优选方案，所述交联型聚乙烯亚胺溶液和肿瘤蛋白抗原溶液的重量比为(0.1 ?3):5。
[0016]作为优选方案，所述交联型聚乙烯亚胺溶液是将交联型聚乙烯亚胺溶解于水中得到。
[0017]作为优选方案，所述肿瘤蛋白抗原溶液是将肿瘤蛋白抗原溶解于缓冲液中得到。
[0018]作为优选方案，所述缓冲液选自PBS、HEPES、生理盐水、Tris、柠檬酸缓冲液、硼酸缓冲液中的任一种。
[0019]与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果:
[0020]本发明将其应用在肿瘤抗原疫苗载体方面，以小鼠骨髓源性树突状细胞(BMDC)为抗原提呈细胞模型，以RF33.70为靶细胞模型，以OVA作为模型抗原，考查可降解PEI制备复合物纳米粒的抗原交叉提呈效果和细胞毒性以及小鼠体内的抗肿瘤效果。
【附图说明】
[0021]通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显:
[0022]图1:复合物纳米粒子的原子力显微镜形貌观察图；
[0023]图2:放大后的复合物纳米粒子的原子力显微镜形貌观察图；
[0024]图3:实施例1中可降解PEI形成的复合物纳米粒子的细胞毒性检测结果；
[0025]图4:实施例1中可降解PEI与OVA形成的复合物纳米粒子的抗原交叉提呈效果；
[0026]图5:实施例1中肿瘤体积大小表征的纳米粒复合物的体内抗肿瘤效果；
[0027]图6:实施例1中小鼠存活率表征的纳米粒复合物的体内抗肿瘤效果；
[0028]图7:实施例2中可降解PEI形成的复合物纳米粒子的细胞毒性检测结果；
[0029]图8:实施例2中可降解PEI与OVA形成的复合物纳米粒子的抗原交叉提呈效果；
[0030]图9:实施例2中肿瘤体积大小表征的纳米粒复合物的体内抗肿瘤效果；
[0031]图10:实施例2中小鼠存活率表征的纳米粒复合物的体内抗肿瘤效果；
[0032]图11:实施例3中可降解PEI形成的复合物纳米粒子的细胞毒性检测结果；
[0033]图12:实施例3可降解PEI与OVA形成的复合物纳米粒子的抗原交叉提呈效果；
[0034]图13:实施例3肿瘤体积大小表征的纳米粒复合物的体内抗肿瘤效果；
[0035]图14:实施例3小鼠存活率表征的纳米粒复合物的体内抗肿瘤效果。
【具体实施方式】
[0036]下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。
[0037]实施例1
[0038]本实施例中使用小分子量的PEI和DTBP合成的含有亚胺键的可降解PEI作为抗原载体材料，合成方法参见文献(M.A.Gosselin, ff.Guo, and R.J.Lee, “Efficientgene transfer using reversibly cross-1 inked low molecular weightpolyethylenimine,，，B1conjugate Chemistry, vol.12，n0.6，pp.989 - 994，2001.) 0
[0039]本实施例的复合物纳米粒子的制备具体步骤如下:
[0040]1、将PEI和DTBP交联形成含有二硫键的可降解PEI的分子量为100Da的聚合物高分子(以下称PE1-DS)溶解于ddH20中，配成0.2mg/mL的储备液；将OVA用pH7.4的1mMHEPES的缓冲液配成5mg/mL的储备液；
[0041]2、涡旋条件下将同等