备方法，所述方法包括以下步骤:
[0035]步骤一，以柠檬酸为碳前驱体，色氨酸为辅助试剂，制备荧光碳点，具体为:
[0036](I)在室温下，称取Ig柠檬酸和20mg色氨酸，量取5mL H20，全部移入25mL玻璃反应瓶中，把该反应瓶放在工作频率为40kHz，功率200W的超声中处理lmin，得到均匀的水溶液；
[0037](2)将步骤⑴中得到的水溶液置于家用微波炉中，在800W功率下进行微波加热4min，反应后得到棕黄色液体；
[0038](3)使用截留分子量为1000的透析袋，透析步骤二中得到的棕黄色液体，透析时间为24h，透析过程中不间断的更换超纯水，以除去未反应的柠檬酸和色氨酸，即可得到色氨酸修饰的超强焚光碳点，量子产率为20%。
[0039]步骤一■，以市售桑香丝为原料制备香丝蛋白，具体步骤为:
[0040](I)脱胶。将蚕茧放入0.5wt%的NaHOV^液中煮沸半个小时，取出脱胶丝，用去离子水冲洗3?4次，最后放入40°C的恒温干燥箱中烘干得到丝素纤维。
[0041](2)丝素溶解。将蚕丝蛋白置于CaCl2-C2H5OH-H2O(摩尔比为:1:2:8)的三元体系中溶解，90 °C保持12h。
[0042](3)纯化。将溶解后的溶液以1000rpm的转速离心20min除去杂质，然后溶液置于透析袋中，在去离子水中透析三天，期间定期换水，以除去溶液中的盐离子。溶液透析好后置于4°C的冰箱中待用。取部分溶液冷冻干燥进行定量。
[0043]步骤三，以碳点和蚕丝蛋白为前驱体合成具有三角体型的SF@C-dots复合纳米颗粒，具体为:
[0044](I)乙醇-水混合冷冻法制备蚕丝蛋白-碳点复合纳米粒子。1ml冰水中加入1.5ml碳点溶液，混合后碳点浓度为lug/ml，保持零度，然后加入200ul lmg/ml的蚕丝蛋白水溶液，继续搅拌1min后，逐滴加入Iml 0°C的乙醇，以后间隔1min在搅拌下逐滴加入Iml O0C的乙醇，加入乙醇的总量为6ml，继续搅拌30min后转入_20°C冰箱保持48小时后取出。
[0045](2)纯化。采用乙醇-水洗离心分离。取沉淀，定量分散在水中。
[0046]上述实施例中，荧光碳点、蚕丝蛋白和水的质量比为1:5:50?1:20:100，在该范围内均可以实现本发明的目的，比如1:5:50,1:20:100以及这两个之间的比例ο
[0047]实施例2
[0048]以实施例1制备得到的SFOC-dots为药物载体，选择盐酸阿霉素(DOX)为药物，以MTT法研究纳米颗粒体体外靶向进细胞以及治疗效果。
[0049]步骤一:不同载药浓度的SF@C-dots-D0X和SFOC-dots与MGC-803胃癌细胞共孵育48小时。
[0050]步骤二:采用MTT法，测定癌细胞的活性。实验结果显示SF@C-dots对癌细胞没有明显的抑制作用，即使当浓度达到400 μ g/ml时，共孵育48小时后，癌细胞的活性依然在90%以上。说明蚕丝蛋白纳米粒子对细胞没有毒性。与此同时，当SF@C-dots-D0X中阿霉素的载药量为10 μ g/ml时，细胞的活性显著下降，在40%以下，说明SFOC-dots-DOX可以有效地杀伤癌细胞。
[0051]图1a和图1b为实施例1备的碳量子点的扫描电镜图SEM图，从中可以看出，SFOC-dots颗粒具有三角体形，颗粒分散性较好；
[0052]图2a是实施例1备的碳量子点的紫外吸收光谱，表征紫外吸收性质；
[0053]图2b是实施例1方法制备的碳量子点的红外光谱，氨基的特征吸收峰分别出现在3432cm \ 1661_1590cm \ 1436_1332cm、1171_1035cm 1 有吸收峰。
[0054]图3是实施例1备的SFOC-dots颗粒分散在水溶液中的荧光激发和发射光谱图，表明SFOC-dots颗粒的具有良好荧光性质；
[0055]图4实施例2浓度SF@C-dots和SFOC-dots-DOX对MGC803细胞活性的抑制作用(不同浓度SF@C-dots和SF@C-dots-D0X和MGC803细胞共孵育48小时后，用MTT法测定细胞的活性)。
[0056]综上所述，本发明旨在采用乙醇-水混合冷冻法合成焚光SF@C-dots颗粒的新方法，醇-水合成体系，操作安全、快捷方便、生物安全性好并且产率高。
[0057]本发明提供的一直以蚕丝蛋白和荧光碳点为前驱体，合成了一种具有三角体型结构具有荧光性能的SFOC-dots复合纳米颗粒，其荧光量子点产率高达20?40%，产率高，方法简单，可操作性强，易于扩大化生产。复合纳米颗粒表面富含氨基，对PH敏感，有望在生物标记、疾病探测，药物输送和缓释载体等实现影像介导下的综合治疗等方面，具有广阔的应用前景；合成方法简单，无需特殊的设备，因此合成成本低廉；分离提纯简单，重复性好，在一般实验室均能完成，易于规模化和推广。
[0058]以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。
【主权项】
1.一种三角体型荧光丝素-碳点复合纳米颗粒的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤: 步骤一，采用氨基酸或者生物活性酶为表面活性剂合成荧光碳点； 步骤二，将天然的桑蚕茧经脱胶-丝素溶解-分离提纯，制备高纯蚕丝蛋白透明水溶液； 步骤三，在冷冻和磁力搅拌的条件下，将荧光碳点和蚕丝蛋白充分的混合于水溶液中，逐滴加乙醇，滴加完成后，继续搅拌，混合反应液迅速转移到冷冻冰箱内静置反应，然后取出，透析法除去未反应物，得到具有三角体型结构的荧光丝素-碳点复合纳米颗粒。2.如权利要求1所述的三角体型荧光丝素-碳点复合纳米颗粒的制备方法，其特征在于，所述桑蚕茧是指家养桑蚕。3.如权利要求1所述的三角体型荧光丝素-碳点复合纳米颗粒的制备方法，其特征在于，所述荧光碳点、蚕丝蛋白和水的质量比为1:5:50?1:20:100。4.如权利要求1所述的三角体型荧光丝素-碳点复合纳米颗粒的制备方法，其特征在于，所述在冷冻和磁力搅拌的条件下，其中冷冻温度为O?4°C。5.如权利要求1所述的三角体型荧光丝素-碳点复合纳米颗粒的制备方法，其特征在于，所述搅拌的搅拌速度在200?1000r/min。6.如权利要求5所述的三角体型荧光丝素-碳点复合纳米颗粒的制备方法，其特征在于，所述搅拌的时间为30?60min。7.如权利要求1所述的三角体型荧光丝素-碳点复合纳米颗粒的制备方法，其特征在于，所述混合反应液迅速转移到冷冻冰箱内静置反应，其中:冷冻冰箱温度为-18°C?_70°C，反应时间为12?72h。8.如权利要求1所述的三角体型荧光丝素-碳点复合纳米颗粒的制备方法，其特征在于，所述乙醇的量为0.1?80%。9.如权利要求1-8任一项所述的三角体型荧光丝素-碳点复合纳米颗粒的制备方法，其特征在于，所述氨基酸为色氨酸、苯丙氨酸、半胱氨酸中一种，所述生物活性酶为核糖核酸酶。10.如权利要求1-8任一项所述的三角体型荧光丝素-碳点复合纳米颗粒的制备方法，其特征在于，所述乙醇纯度为分析纯。
【专利摘要】本发明提供了一种三角体型荧光丝素-碳点复合纳米颗粒的制备方法；包括以下步骤：步骤一，采用氨基酸或者生物活性酶为表面活性剂合成荧光碳点；步骤二，将天然的桑蚕茧经脱胶-丝素溶解-分离提纯，制备高纯丝素透明水溶液；步骤三，在冷冻和磁力搅拌的条件下，将荧光碳点和蚕丝蛋白充分的混合于水溶液中，逐滴加乙醇，滴加完成后，继续搅拌，混合反应液迅速转移到冷冻冰箱内静置反应，然后取出，透析法除去未反应物，得到具有三角体型结构的荧光丝素-碳点复合纳米颗粒。本发明方法利用纳米颗粒表面的蚕丝蛋白对pH敏感性质，实现药物在特定部位的控制释放，在药物靶向运输和控制释放方面，具有广阔的应用前景。
【IPC分类】A61K49/00, A61K47/42, C09K11/65
【公开号】CN105012962
【申请号】CN201510310085
【发明人】沈广霞, 胡美昕, 刘慧旸, 崔大祥
【申请人】上海交通大学
【公开日】2015年11月4日
【申请日】2015年6月8日