一种重组伪狂犬病病毒疫苗耐热冻干保护剂及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及疫苗助剂领域，具体涉及一种重组伪狂犬病病毒疫苗耐热冻干保护剂 及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 重组伪狂犬病毒，如保藏在中国典型培养物培养中心、保藏号为：CCTCC-V201408 的重组伪狂犬病毒，用于制备猪伪狂犬病防治用的疫苗；现有的疫苗中，弱毒活疫苗是预 防畜禽传染病的主要疫苗之一，在我国动物用疫苗中活疫苗占相当大的比例。将活疫苗进 行冻干保存，为疫苗的运输、保存和使用提供了很多的方便。目前，现有的活疫苗耐热冻干 保护剂，如常用的猪用冻干活疫苗耐热保护剂，其主要成分为脱脂牛奶、蔗糖和明胶。虽然 上述组方简单，成本较低，但其保护性能差，保存时间较短，在2°C -8°C条件下，保存期只有 3-6个月，且多需要在-15°C以下保存，使疫苗的长期保存和长途运输受到很大限制。
【发明内容】
[0003]本发明的目的在于提供一种能够在较高温度和较长时间保存重组伪狂犬病病毒 疫苗耐热冻干保护剂，本发明还提供该耐热冻干保护剂的制备方法。
[0004] 为解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下：
[0005] -种重组伪狂犬病病毒疫苗耐热冻干保护剂，其由按照重量百分数计的如下 组分制成：明胶2-3 %、聚乙烯吡咯烷酮K-30 1-2 %、海藻糖0-4 %、蔗糖2-5 %、甘露醇 0. 1-0. 5%、黄芪多糖0-0. 5%、甘氨酸1-1. 5%、精氨酸0-1%、牛血清白蛋白0-1%，余量为 注射用水。
[0006] 本发明中，优选的方案为所述的重组伪狂犬病病毒疫苗耐热冻干保护剂由按照重 量百分数计的如下组分制成：明胶2. 5%、聚乙烯吡咯烷酮K-30 2%、海藻糖4%、蔗糖2%、 甘露醇0. 1 %、黄芪多糖0. 5 %、甘氨酸1. 5 %、精氨酸1 %、牛血清白蛋白1 %，余量为注射用 水。
[0007]本发明中，优选的方案为所述重组伪狂犬病病毒疫苗保藏于中国典型培养物培养 中心，保藏号为：CCTCC-V201408。
[0008]本发明还提供该重组伪狂犬病病毒疫苗耐热冻干保护剂的制备方法，其包括如下 步骤：
[0009] a.取明胶、聚乙烯吡咯烷酮K-30、海藻糖、蔗糖、甘露醇和黄芪多糖，然后溶于部 分注射用水中，该部分的注射用水占注射用水总量的3/5_4/5,然后在110-120°C的温度下 进行灭菌处理10-20min，得到溶液A ;
[0010] b.取配方量的甘氨酸、精氨酸和牛血清白蛋白，溶于剩余部分的注射用水中，然后 用孔径为〇. 18-0. 24 y m的滤膜过滤除菌，得到溶液B ;
[0011] c.将a步骤得到的溶液A与b步骤得到的溶液B混合，即得产品。
[0012] 本发明中，优选的方案为所述a步骤中，在115°C的温度下进行灭菌处理15min。
[0013] 本发明中，优选的方案为所述b步骤中，滤膜孔径为0. 22 ym。
[0014] 与现有技术相比，本发明具有如下优点：本发明的耐热冻干保护剂中，在冻干过程 中聚乙烯吡咯烷酮K-30能够对病毒起到很好的保护作用，同时又是很好的填充剂，对生物 制品（即疫苗）起到很强的支撑作用；海藻糖能形成独特的保护膜，有效地保护生物分子 结构不被破坏，这一功能在蔗糖、葡萄糖等其他糖类均不具备；甘氨酸则是一种很好的赋形 剂；甘露醇可以提高疫苗产品的坍塌温度，结合其余的组分一起，使得应用本发明冻干保护 剂的疫苗不仅外观良好，且病毒的损失率低，耐老化程度高，能够使得疫苗能够在较高温度 和较长时间保存。
[0015] 下面结合【具体实施方式】及附图对本发明进行详细说明。
【附图说明】
[0016] 图1为冻干保护剂配方的冻干曲线图；
[0017] 图2为用ELISA方法检测的免疫猪体内的PRVgB抗体平均值数据图；
[0018] 图3为用ELISA方法检测的免疫猪体内的PCV2抗体平均值数据图；
[0019] 其中，20120701，20120702,20120703 分别为根据实验例 2. 3. 1PCV2-PRV 二联基因 工程活疫苗的试制的方法制得的3批PCV2-PRV二联基因工程活疫苗的批号。
【具体实施方式】
[0020] -种重组伪狂犬病病毒疫苗耐热冻干保护剂，其由按照重量百分数计的如下 组分制成：明胶2-3 %、聚乙烯吡咯烷酮K-30 1-2 %、海藻糖0-4 %、蔗糖2-5 %、甘露醇 0. 1-0. 5%、黄芪多糖0-0. 5%、甘氨酸1-1. 5%、精氨酸0-1%、牛血清白蛋白0-1%，余量为 注射用水。
[0021] 本发明的【具体实施方式】中的，所用到的蔗糖、海藻糖、聚乙烯吡咯烷酮（PVP)、牛血 清白蛋白（BSA)、甘露醇、甘氨酸、精氨酸，均购自Amresco公司；所用到的明胶、黄苗多糖均 由新兴化药分公司提供。
[0022] 本发明实施例中的重组伪狂犬病病毒疫苗耐热冻干保护剂的制备方法，其包括如 下步骤：
[0023] a.取明胶、聚乙烯吡咯烷酮K-30、海藻糖、蔗糖、甘露醇和黄芪多糖，然后溶于部 分注射用水中，该部分的注射用水占注射用水总量的4/5,然后在115°C的温度下进行灭菌 处理15min，得到溶液A;
[0024] b.取配方量的甘氨酸、精氨酸和牛血清白蛋白，溶于剩余部分（即占注射用水总 量的1/5)的注射用水中，然后用孔径为0. 22 y m的滤膜过滤除菌，得到溶液B;
[0025] c.将a步骤得到的溶液A与b步骤得到的溶液B混合，即得产品。
[0026] 实施例1-5、对比例1-3
[0027] 本发明的实施例1-5、对比例1-3的耐热冻干保护剂，具体的配方组成详见下表 1 (配方表中的数字代表质量百分数），
[0028] 表1 :实施例、对比例的耐热冻干保护剂配方表
[0029]
[0031] 实验例
[0032] 对本发明的实施例、对比例制得的重组伪狂犬病病毒疫苗耐热冻干保护剂，对其 性能进行测试；
[0033] 1. 1 材料
[0034] 1. 1. 1病毒和细胞
[0035] 重组病毒rPRV_0RF2为发明人自主构建与保存，该重组病毒保藏在中国典型培养 物培养中心、保藏号为：CCTCC-V201408 ;该重组病毒可有效表达PCV2的0RF2基因，可用于 制备PCV2-PRV二联基因工程疫苗。ST细胞购自中国兽药监察所。
[0036] 1. 1. 2血清、培养基和胰蛋白酶类试剂
[0037] 胎牛血清、DMEM培养基购自Gibco公司，胰蛋白酶为Sigma公司产品。氯化钠、氯 化钾、葡萄糖、NaHC0 3、EDTA为分析纯试剂。
[0038] 1. 1. 3试验动物与抗体检测试剂盒
[0039] 35日龄PRV抗体阴性、PCV2抗体阴性断奶仔猪购自新兴某猪场，PRV gB抗体检测 试剂盒为IDEXX公司产品，PCV2抗体检测试剂盒为武汉科前公司产品。
[0040] 1. 2 方法
[0041] 1. 2. 1制苗用毒液的制备与毒价测定
[0042] 选用生长良好单层ST细胞，倾去细胞生长液，加入0. 2%。重组病毒rPRV-0RF2病毒 液，37°C吸附lh后，加入适量细胞维持液（2% FBS的DMEM)，37°C继续培养，当全部细胞出 现CPE时，冻融收获病毒，置-80°C以下保存备用。按Reed-Muench两氏法测定与计算病毒 滴度 TCID5。。
[0043] 1. 2. 2耐热保护剂配方的确定
[0044] 取实施例1-5、对比例1-3的耐热冻干保护剂。将各配方保护剂分别与rPRV-0RF2 病毒悬液以1 : 1混合配苗分装，2mL/瓶，按照设计的冻干曲线进行冻干试验，冻干后测 定毒价，筛选出最佳的耐热保护剂配方，确定为生产条件。产品在_80°C预冻过夜后，转入 CHRIST公司的ALPHA1-4冻干机的冻干箱内，探索主干燥时的真空度及干燥时间以确定最 佳的冻干曲线。
[0045] 1. 2. 3PCV2-PRV二联基因工程活疫苗的生产
[0046] 按1. 2. 2筛选出的最佳保护剂配方配制保护剂，与rPRV-0RF2病毒悬液配苗，生产 3批PCV2-PRV二联基因工程活疫苗。
[0047] 1.2. 4疫苗的安全性检验与毒价测定
[0048] 疫苗的安全性检验：每批疫苗注射35日龄PRV抗体与PCV2抗体阴性的健康断奶 仔猪5头，颈部肌肉注射10头份/头，连续观察局部及全身性不良反应21日。
[0049] 疫苗的毒价测定：以ST细胞按Reed-Muench两氏法测定与计算疫苗滴度TCID5。。
[0050] 1.