ii L不同发酵萃取条件的豆类发酵萃取物，分别加入200 ii L 的10% Folin-Ciocalteu试剂混合均匀后，再加入800 ii L的700mM Na2CO3混合均匀，室温 避光静置2小时后，于波长765nm下测定其吸光值。最后数据依标准曲线换算成标准单位 mg GA/mL〇
[0032] 请参照表1，为初步挑选总多酚化合物含量较高的豆类发酵萃取物的发酵萃取条 件。发酵条件为于红豆中添加枯草杆菌及浓度为〇%至2%的葡萄糖、乳糖或蔗糖，于25°C 至40°C发酵24至96小时。萃取溶剂可为水或50%乙醇溶液。
[0033] 表1、不同发酵与萃取条件下豆类发酵萃取物的总多酚含量
[0034]
[0035] 试验例2 :-氧化氮（NO)抑制能力分析
[0036] 因为生物体于发炎反应时会产生大量的NO自由基，因此利用脂多糖类 (Lipopolysaccharide, LPS)来诱发巨嗤细胞来产生NO自由基，再利用Griess试剂来评估 豆类发酵萃取物的抗发炎活性，为一简单且可信的生物活性试验方法。当生物体产生不稳 定的NO时，很快的在组织中会氧化成稳定的产物亚硝酸（nitrite)或硝酸（nitrate)，因此 可以Griess试剂进行呈色反应来定量N0。
[0037] 本试验例依照上述总多酚化合物含量试验所挑选出的豆类发酵萃取物，进一步分 析豆类发酵萃取物对于NO的抑制能力。大鼠巨噬细胞RAW264. 7是购自食品工业发展研究 所生物资源保存及研究中心（Bioresource Collection and Research Center ;BCRC)。先以 LPS诱导RAW264. 7产生NO,再以Griess试剂测定RAW264. 7细胞在添加LPS，及同时添加 LPS和本发明的豆类发酵萃取物的亚硝酸盐生成量，以计算NO抑制率。
[0038] RAW264. 7 细胞培养液为含 10 % 胎牛血清（Fetal bovine serum ;FBS)的 DMEM (Dulbecco' s Modified Eagle Medium)培养液。进行 NO 抑制率分析时，先将 RAW264. 7 细胞以3X105cells/well的浓度接种于96孔微量盘中，于37°C、5% CO2培养箱中培养24 小时后，分别给予不同发酵萃取条件的豆类发酵萃取物及I U g/mL的LPS，再于37°C、5% CO2培养箱中培养24小时。培养后将培养液吸出，用磷酸缓冲液（PBS)洗两次，加入100 ill Griess 试剂〔溶于 5% H3PO4 的 1%磺胺（sulphanilamide)及 0? 1%N-(L-萘基）-乙二胺 二盐酸盐（N-(L-naphthyl)-ethylene diaminedihydrochloride)〕，室内避光反应 10 分 钟后，以酶免疫分析测读仪测定在波长540nm的吸光值。并以亚硝酸钠为标准品作出标准 曲线，换算样品组的亚硝酸盐生成量，依公式计算其NO抑制率。公式如下：NO抑制率（％ ) =([NO2Utrcil- [N02]s_)/[N02]_trol。其中[N0 2]_trol 为仅添加诱发剂LPS 时 NO2 的 浓度；[NO2 为同时添加诱发剂LPS与豆类发酵萃取物样品时NO 2的浓度。
[0039] 请参照表2,为挑选出具有最佳NO抑制率的豆类发酵萃取物的发酵萃取条件。发 酵条件为于红豆中添加枯草杆菌及浓度为0%至2%的葡萄糖、乳糖或蔗糖，于25°C至40°C 发酵24至72小时。萃取溶剂可为水或50%乙醇。
[0040] 表2、不同发酵与萃取条件下豆类发酵萃取物的NO抑制率
[0041]
[0042] 试验例3 :环氧合酶-2 (C0X-2)抑制剂分析
[0043] 环氧合酶2&7(：1〇(?7861^86-2,0?-2)为巨噬细胞中的发炎因子，常在发炎部位 发现有大量C0X-2表现，当身体组织受到某种刺激如外伤、感染等会活化C0X-2,使得前列 腺素（prostaglandins, PGs)大量生成,具有促进发炎、血管新生、抑制细胞凋亡并促使癌 细胞生长的作用。
[0044] 本试验例依照上述NO抑制率试验所挑选出的豆类发酵萃取物，进一步分析豆类 发酵萃取物抑制C0X-2活性的能力。环氧合酶会催化花生四烯酸（AA)生成PGH2,而PGH2会 藉由氯化亚锡而还原成PGF2 a，此可利用酶免疫分析法测定PGF2 a的含量，以计算C0X-2 抑制率。C0X-2抑制率的计算方式如下：抑制率（％) =〔（PGc - PGs)/PGc〕X 100。其中 PGc为100 %初始活性的PGF2 a浓度，PGs为豆类发酵萃取物样品的PGF2 a浓度。本试验 是利用 COX-(human recombinant)-inhibitor screening kit (Catalog No. 560131，Cayman Chemical, Ann Arbor, MI)测定豆类发酵萃取物的抑制C0X-2能力。
[0045] 请参照表3,为挑选出具有最佳C0X-2抑制率的豆类发酵萃取物的发酵萃取条件。 发酵条件为于红豆中添加枯草杆菌及浓度为〇%至2%的乳糖或蔗糖，于25°C至40°C发酵 24至72小时。萃取溶剂可为水或50%乙醇。
[0046] 表3、不同发酵与萃取条件下豆类发酵萃取物的C0X-2抑制率
[0047]
[0048] 由上所述，经本发明所揭露的制造方法及所制造的豆类发酵萃取物，可将豆类的 营养转换成具有生理活性的功能性成分，例如总多酚化合物。并于抗发炎活性分析结果显 示其具有抑制NO生成及降低C0X-2的活性等抗发炎活性。故本发明的豆类发酵萃取物可 用于抗发炎诉求的医药组合物、饲料组合物、饮料组合物、营养补充组合物、食用组合物以 及保健食用组合物上，具有运用于生医保健市场的潜能。
[0049] 然本发明已以实施方式揭露如上，然其并非用以限定本发明，任何熟悉此技艺者， 在不脱离本发明的精神和范围内，当可作各种的更动与润饰，因此本发明的保护范围当视 后附的权利要求书所界定的范围为准。
【主权项】
1. 一种豆类发酵萃取物的制造方法，包含： 将豆类浸泡于水中经高温高压灭菌，以形成豆类基质； 使所述豆类基质冷却达KTC至40°C ; 于冷却后的所述豆类基质中加入一菌种后，进行发酵制程，以获得发酵产物，其中所述 菌种为枯草杆菌菌株（Bacillus subtilis)，且所述发酵制程是于25°C至40°C发酵24至72 小时；以及 对所述发酵产物进行萃取制程，以获得上清液，其中所述上清液包含豆类发酵萃取物， 且所述豆类发酵萃取物具有抗发炎活性。2. 如权利要求1所述的豆类发酵萃取物的制造方法，其中所述豆类为红豆（Phaseolus radiatus L. var. aureus Prain) 〇3. 如权利要求1所述的豆类发酵萃取物的制造方法，其中所述发酵制程更至少包含于 冷却后的豆类基质加入糖类，其中所述糖类于所述豆类基质的浓度为〇. 5重量百分比至2 重量百分比。4. 如权利要求3所述的豆类发酵萃取物的制造方法，其中所述糖类是选自于由乳糖以 及蔗糖所组成的群组。5. 如权利要求1所述的豆类发酵萃取物的制造方法，其中所述萃取制程更至少包含： 利用一溶剂与所述发酵产物以重量比10 :1至30 :1的比例混合成混合物后，于KTC至 40°C搅拌所述混合物达2小时至4小时，其中所述溶剂为水或浓度为50%重量百分比的乙 醇；以及 去除所述混合物的固体成份，以获得上清液。6. 如权利要求5所述的豆类发酵萃取物的制造方法，其中所述固体成份是利用离心方 式、过滤方式、沉淀方式或上述方式的组合而去除。7. -种豆类发酵萃取物，其是利用如权利要求1至6的任一项的方法所制得，其中所述 豆类发酵萃取物具有抗发炎活性。8. 如权利要求7所述的豆类发酵萃取物，其中所述豆类发酵萃取物是用以抑制一氧化 氮的生成。9. 如权利要求7所述的豆类发酵萃取物，其中所述豆类发酵萃取物是用以降低环氧合 酶2的活性。10. -种抗发炎的组合物，其中所述组合物包含一有效剂量的豆类发酵萃取物，且所述 豆类发酵萃取物包含如权利要求7至9任一项的豆类发酵萃取物。11. 如权利要求10所述的抗发炎的组合物，其是呈选自以下群组的一形式：医药组合 物、饲料组合物、饮料组合物、营养补充组合物、食用组合物以及保健食用组合物。
【专利摘要】本发明提供一种豆类发酵萃取物，其是以下列步骤所得：将豆类浸泡于水中经高温高压灭菌，以形成豆类基质。使豆类基质冷却后，加入枯草杆菌(Bacillus？subtilis)进行发酵，以获得发酵产物。最后对发酵产物进行萃取制程，以获得上清液，其中上清液包含豆类发酵萃取物，且豆类发酵萃取物具有抗发炎活性。本发明另提供一种前述豆类发酵萃取物的制造方法及组合物。
【IPC分类】A23K1/16, A23L2/52, A23L1/30, A61K36/48, A61P29/00
【公开号】CN105079079
【申请号】CN201410188182
【发明人】钟雲琴, 周淑姿, 王俊权, 王培铭, 张珍田, 王铭富, 詹恭巨, 邱雲棕, 詹吟菁
【申请人】静宜大学
【公开日】2015年11月25日
【申请日】2014年5月6日