的教导，这些片段、衍生物和 类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。例如，在本发明中，术语"人HNF1A-AS1 RNA" 指具有野生型HNF1A-AS1序列的RNA。该术语还包括具有与人HNF1A-AS1 RNA相同的抑制 实体瘤功能的、野生型序列的变异形式。这些变异形式包括（但并不限于）：一个或多个核 苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5'末端和/或3'末端添加一个或数个核苷酸。例 如，在本领域中，用性能相近核苷酸进行取代时，通常不会改变RNA的功能。又比如，在5' 末端和/或3'末端添加一个或数个核苷酸通常也不会改变RNA的功能。同样，该术语还包 括人HNF1A-AS1的活性片段。
[0038] 本发明还包括人HNF1A-AS1 RNA的类似物。这些类似物与天然人HNF1A-AS1 RNA 的差别可以是核酸序列上的差异，也可以是不影响序列的核苷酸修饰形式上的差异，或者 兼而有之。类似物还包括具有不同于天然核苷酸碱基的类似物，以及具有非天然存在的或 合成的核苷酸的类似物。
[0039] 本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。
[0040] DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。
[0041] 在本发明中，人HNF1A-AS1核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组 法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据人HNF1A-AS1的核苷酸序列来设计引 物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩 增而得有关序列。一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这 通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到 有关序列。
[0042] 本发明也涉及包含HNF1A-AS1序列的载体（尤其是病毒载体），以及用本发明的 载体或HNF1A-AS1序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经体外转录技术产生本发明所述 RNA的方法。
[0043] 将多核苷酸导入组织或细胞内的方法包括：将多聚核苷酸直接注入到体内组织 中；或在体外通过载体（如病毒、噬菌体或质粒等）先将多聚核苷酸导入细胞中，再将细胞 移植到体内等。重组的基因治疗载体（如病毒载体）可设计成表达野生型的HNF1A-AS1，以 增加实体瘤中HNF1A-AS1的数量和活性。来源于病毒的表达载体如逆转录病毒、腺病毒、腺 病毒相关病毒、单纯疱疹病毒、细小病毒等可用于将HNF1A-AS1基因转移至细胞内。构建携 带HNF1A-AS1基因的重组病毒载体的方法可见于已有文献（Sambrook, et al.)。另外重组 人HNF1A-AS1基因/RNA可包装到脂质体中，然后再转入细胞内。
[0044] 本发明HNF1A-AS1RNA、HNF1A-AS1DNA及载体，当施用（给药）于哺乳动物对象 (如人）时，可抑制恶性实体瘤的恶性表型。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药 学上可接受的载体介质（包括水性载体介质），形成药物组合物。水性载体介质的PH通常 约为5-8,较佳地pH约为6-8,尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所 变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括（但并不限于）：瘤内、 肌内、腹膜内、静脉内、皮下、皮内、或局部给药。
[0045] 本发明的药物组合物可直接用于诱导实体瘤的治疗，代表性的例子包括（但 并不限于）：肝癌、胃癌、肠癌、胰腺癌、肾癌、前列腺癌及生殖腺肿瘤等。在使用本发明 HNFlA-AS 1基因/RNA或药物组合物时，还可同时或辅助使用其他治疗剂，如顺铂、TNF等，还 可与其他基因如HSK-TV基因、P53基因等其他基因或化疗与放疗联合治疗。
[0046] 本发明还提供了一种药物组合物，它含有（a)安全有效量（如0? 0001_99wt% ) 的本发明HNF1A-AS1 RNA、HNF1A-AS1 DNA或载体以及（b)药学上可接受的载体或赋形剂。 这类载体包括（但并不限于）：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂 应与给药方式相匹配。本发明药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡 萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。诸如片剂和胶囊之类的药物组合物，可 通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液、片剂和胶囊宜在无菌条件下制造。本发 明药物组合物中还可含有其他治疗剂，如化疗药物。使用药物组合物时，是将安全有效量的 HNF1A-AS1 RNA、HNF1A-AS1 DNA或载体施用于哺乳动物。当然，具体剂量还应考虑给药途 径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。
[0047] 本发明还提供了一种肿瘤细胞（尤其是恶性实体瘤）基因治疗的方法，它包括将 HNF1A-AS1基因导入肿瘤细胞，使之表达，其中所述将HNF1A-AS1基因导入肿瘤细胞的方法 包括用质粒转染、腺病毒或腺相关病毒介导。
[0048] 本发明的有益效果如下：
[0049] (a)筛选并证实长链非编码RNA HNF1A-AS1对恶性实体瘤的抑制作用。
[0050] (b)体内外证实HNF1A-AS1治疗恶性实体瘤的可行性及其对临床研究的潜在意 义。
【附图说明】
[0051] 图I. Real-Time PCR检测HNF1A-AS1在肝癌细胞株中的表达。
[0052] 图2.Real-TimePCR检测HNF1A-AS1在肝癌组织及其对应癌旁组织中的表达。
[0053] 图 3. cDNA 末端快速扩增技术（rapid amplification of cDNA ends，RACE)扩增 HNF1A-AS1 cDNA 的 5'末端（A)和 3'末端（B)。
[0054] 图4.根据HNF1A-AS1 cDNA的5'末端和3'末端延伸获得的HNF1A-AS1全长基 因核苷酸序列。
[0055] 图5. PCR方法扩增获得全长HNF1A-AS1的cDNA。
[0056] 图6?酶切鉴定重组慢病毒载体p⑶H-HNF1A-AS1。
[0057] 图7?对照慢病毒Ienti-Ctrl⑷或慢病毒Ienti-HNFlA-ASl⑶分别感染Huh7 细胞3天后绿色荧光表达情况。
[0058] 图8. Ienti-HNFlA-ASl慢病毒感染Huh7细胞⑷和Ifep3B细胞⑶4天后 Real-Time PCR检测HNF1A-AS1基因的表达水平。
[0059] 图9.外源导入HNF1A-AS1抑制肝癌细胞Huh7(A)和H印3B(B)的增殖。图10.外 源导入HNF1A-AS1抑制肝癌细胞Huh7(A)和H印3B(B)的克隆形成能力。
[0060] 图11.外源导入HNF1A-AS1可使Ifep3B细胞发生G2期细胞阻滞，其中A为对照细 胞流式细胞仪周期检测图，B为HNF1A-AS1过表达组细胞流式细胞仪周期检测图，C为A、B 图细胞周期数据统计图。
[0061] 图 12?外源导入 HNF1A-AS1 抑制肝癌细胞 Huh7 (A)、Ifep3B (B)、MHCC-H(C)的迀移 能力。
[0062] 图13.分别感染对照慢病毒Ienti-Ctrl或慢病毒Ienti-HNFlA-ASl的Huh7细 胞的体内接种成瘤实验，其中A为肿瘤生长速率，B为小鼠成瘤在体图（上）及肿瘤离体图 (下），C为瘤体HNFIA-ASl基因表达水平。
[0063] 图14. HNF1A-AS1基因治疗肝脏原位种植瘤实验，其中A为两组小鼠注射病毒前 后活体呈像荧光检测图；B为小鼠肝脏及瘤体离体图，其中箭头指向为肿瘤组织；C为瘤体 HNFIA-ASl基因表达水平。
【具体实施方式】
[0064] 现结合实施例和附图，对本发明作详细描述，但本发明的实施不仅限于此。
[0065] 本发明所用试剂和原料均市售可得或可按文献方法制备。下列实施例中未注明 具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人《分子克隆：实验室指南》（New York :Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照常规条件，或 按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
[0066] 实施例1 :Real-Time PCR检测人肝肿瘤细胞株HNF1A-AS1基因的表达情况
[0067] L将市售的常规肝肿瘤细胞株H印G2、Huh7、H印3B、MHCC-L、MHCC-H、LM3、PLC、 Focus均以5XIO5/皿接种于六孔板，以含10%胎牛血清的新鲜培养液培养，第二天抽提细 胞RNA，分光光度计测定0D260值，1 %琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性。
[0068] 2.Real-TimePCR：
[0069] 取 I y g RNA加入4 y I 5XPrimeScript RT master mix (逆转录试剂盒），另加入 DEPC水补足体积至20 y 1，37°C反应15min ;85°C反应5s灭活逆转录酶，即可