得到逆转录产 物。将逆转录产物稀释后取I y 1为模板进行HNF1A-AS1 PCR扩增，同时以P -actin作为 内参照在相同反应条件下进行PCR反应，反应体系如下：
[0070]
[0071] 反应条件为 95 °C，30sec ;95 °C，5sec - 60 °C，34sec，40 个循环；95 °C， 15sec - 60°C，60sec - 95°C，15sec。相关引物序列见表：
[0072] 0-actin正向引物：CATCCTGCGTCTGGACCT(SEQIDN0:2);
[0073] 反向引物：GTACTTGCGCTCAGGAGGAG(SEQIDN0:3);
[0074] HNF1A-AS1 正向引物：CAAGAAATGGTGGCTATGA (SEQ ID NO: 4);
[0075] 反向引物：TGGACTGAAGGACAAGGGT (SEQ IDNO: 5)。
[0076] Real-TimePCR检测各肝癌细胞株HNF1A-AS1的基因表达水平。结果如图I所示， 在H印G2、MHCC-L细胞中HNF1A-AS1的基因表达水平相对较高，而Huh7、H印3B、MHCC-H细 胞中HNF1A-AS1的基因表达水平居中，而PLC、LM3、Focus中HNF1A-AS1的基因表达水平相 对较低。
[0077]
[0078] 实施例2 :Real-Time PCR检测HNF1A-AS1在肝癌组织及其对应癌旁组织中的表达
[0079] 取53例肝癌患者术后肝癌组织（样本来源：东方肝胆外科医院），采用Trizol法 抽提其RNA，分光光度计测定0D260值，1 %琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性。
[0080] 按照实施例1中RNA逆转录方法逆转录得到肝癌组织标本的cDNA，将cDNA稀释 后按照实施例1上述同样方法和条件检测人肝癌组织中HNF1A-AS1的表达情况，同时以 0 -actin基因的表达情况作为内参照，结果表明HNF1A-AS1在肝癌组织中表达下调（图 2) 〇
[0081] 实施例 3 :cDNA 末端快速扩增技术（rapid amplification of cDNA ends，RACE) 扩增HNFIA-ASl基因全长
[0082] 根据HNF1A-AS1已知的序列分别设计5'末端特异性扩增引物（5' GSP) AACTCGGACTGITCTCCTTCCCACCCC(SEQ ID N0:6)和 3' 末端特异性扩增引物（3' GSP) ACGGCTAGTAAACGGCAGAACGAGGC (SEQ ID NO: 7)，合成引物。
[0083] 采用市售CL0NTECH的Marathon?试剂盒扩增HNF1A-AS1基因的cDNA序列，试剂 盒中包括接头引物（adaptor primer)及预制好的人肝脏cDNA，采用以下PCR体系进行扩 增。
[0084] PCR扩增体系：
[0085]
[0086] 混匀各组分，离心后放入PCR仪中进行扩增反应。
[0087] 反应条件：94°C，5min ;94°C 30sec，7(TC 30s，72°C lmin，40 个循环；72°C 7min， 4。。°° 〇
[0088] PCR扩增分别得到HNF1A-AS1的5'末端和3'末端片段，I %琼脂糖凝胶电泳分 离鉴定产物（图3)，选择最长片段割胶回收置入Eppendorf管内，称取胶重量，按每IOOmg 胶/200ml NT液的比例加入NT液，50°C，5-10min至凝胶熔化；将液体过柱，13, OOOrpm离 心lmin，加入700 y I NT3洗涤液，13, OOOrpm离心Imin ;洗涤2次。将纯化柱置于干净的 Eppendorf管上，开盖瞭置lmin，滴加30 y 1双蒸水至柱内滤膜上，静放2min，13, OOOrpm 离心lmin，过柱洗脱得到DNA片段，分光光度计测定其浓度。分别取纯化后的HNF1A-AS1的 5'末端或3'末端片段4 y l、pMD-19T载体I y l、solution I连接酶混合液5 y 1，16°C连接 3h。将连接产物加入常规的感受态大肠杆菌DH5 a转化，用含氨苄青霉素的LB培养基平皿 铺板，37°C恒温过夜，挑取单菌落克隆至含氨苄青霉素的LB液体培养基中培养，待菌液浓 度0D600 = 0. 8-1. 0,送至英骏生物公司测序。
[0089] 测序结果表明HNF1A-AS1基因与NCBI数据库提供的序列（基因ID : NR_024345. 1) 5'末端有330bp的延伸（图4中方框中所标序列），全长为2785bp，是一连续 序列无其他剪切形式的长链非编码RNA。其基因全长序列为SEQ ID NO: 1。
[0090] 实施例4 :构建HNF1A-AS1基因过表达慢病毒
[0091] 1?构建HNF1A-AS1基因过表达慢病毒载体
[0092] 根据新得到的HNF1A-AS1的基因序列设计并合成引物：
[0093] 正向引物：GGAACAGCCGGACATGGTAG (SEQ ID NO: 8);
[0094] 反向引物：GACGGAGITTCGITCTTGITCC(SEQIDNO:9);
[0095]同时分别带有BamHI和EcoRI酶切位点，以人肝脏cDNA为模板，PCR扩增 HNF1A-AS1序列，产物0. 7 %凝胶电泳鉴定，鉴定结果如图5所示，大小正确则采用试剂盒纯 化回收PCR扩增片段。
[0096] BamH I和EcoR I分别酶切pCDH质粒（购自美国System Biosciences公司） 和HNF1A-AS1的PCR扩增片段，凝胶电泳鉴定并纯化回收酶切后产物。取50-100ng线性 化的 pCDH 质粒、500-1000ng BamH I 和 EcoR I 酶切后的 HNF1A-AS1 片段，5 y I solution I连接酶混合液，混匀后16°C连接过夜。将连接产物加入慢病毒载体专用感受态大肠杆菌 Stb 13转化，用含氨苄青霉素的LB培养基平皿铺板，37 °C恒温过夜，挑取单菌落克隆至含氨 苄青霉素的LB液体培养基中培养，送适量菌液至公司测序。测序正确即得到慢病毒重组表 达质粒PCDH-HNF1A-AS1，选择BamH I和EcoR I酶切鉴定重组表达质粒pCDH-HNFlA-ASl， 如图6所示出现一个7kb左右片段为载体片段，另一 3kb左右片段为HNF1A-AS1 cDNA片段， 表明质粒正确（图6)。
[0097] 2.慢病毒的包装
[0098] 按4X IO6个HEK293T细胞/皿的密度接种至IOmm培养皿12-24h后，用 FuGENE?HD6将2500ng对照质粒pCDH-Ctrl或慢病毒重组质粒pCDH-HNFlA-ASl分别 与1875ng psPAX2、625ng pMD2. G包装质粒共转染HEK293T细胞，5% C02培养箱中培养12h 后换成含有10%胎牛血清（FBS)的杜氏培养基（DMEM)，24h后收集上清储存于4°C，重新加 入IOml上述培液继续培养24h，收集上清，混合两次收集的上清，1250rpm离心5min后取上 清即得到对照慢病毒Lenti-Ctrl或携带有HNF1A-AS1基因的慢病毒Lenti-HNFlA-ASl。
[0099] 实施例5 :Real-TimePCR检测Lenti-HNFlA-ASl感染人肝肿瘤细胞株后 HNF1A-AS1基因的表达水平
[0100] 人肝肿瘤细胞株Huh7和H印3B均以3X IO5个细胞/皿的密度接种至35mm培养 皿，分别加入500 y 1慢病毒Lenti-Ctrl或Lenti-HNFlA-ASl，24h-48h后更换含10%胎牛 血清的新鲜DMEM培液，培养3天后观察荧光表达情况，发现对照病毒和HNF1A-AS1病毒感 染后的细胞均可看到明显绿色荧光（图7)，表明病毒成功感染细胞。5天后以Trizol试剂 盒抽提总RNA，并采用分光光度计测定0D260值，同时1 %琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性。
[0101] 按照实施例1中RNA逆转录方法逆转录得到cDNA，将cDNA稀释后按照实施例1上 述同样方法和条件检测感染慢病毒Lenti-HNFlA-ASl后Huh7和H印3B细胞中HNF1A-AS1 基因的表达情况，同时以P -actin基因的表达情况作为内参照，结果表明感染慢病毒 Lenti-HNFlA-ASl后Huh7和H印3B细胞中HNF1A-AS1基因的表达均出现明显上调（图8)。
[0102] 实施例6 :外源导入HNF1A-AS1抑制肝肿瘤细胞增殖
[0103] 人肝肿瘤细胞株Huh7和H印3B均以2XIO5接种于35mm培养皿，分别感染对照慢 病毒Lenti-Ctrl(对照组）或慢病毒Lenti-HNFlA-ASl(实验组）48h后，计数每孔3XIO3个 细胞均匀分至96孔板，每天检测3复孔连续检测7天。第二天采用无血清培养基配置10% 的CCK8,吸去96孔中原有培液，加入100y1配