一种脱细胞脑组织三维支架的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及细胞外基质(ECM)制备领域，具体地说，本发明提供了一种脱细胞脑组织三维支架，其是通过使用碱性去离子水处理脑组织获得。
【背景技术】
[0002]机体内各种器官及组织可以视为由两部分构成:细胞和细胞外成分(也称为细胞外基质，简称ECM)。大部分免疫原性的物质存在于细胞内。相比单一或复合的人工合成生物分子材料，脱去细胞后的细胞外基质不仅有更接近天然的生物体内的细胞外环境，而且最大程度保留了其生物活性，在组织工程中得到越来越多的重视和应用。
[0003]对于细胞外基质制备的研究始于20世纪90年代初，细胞外基质制备是通过脱出组织细胞的方法去除存在于细胞内的免疫原性成分，以得到可以用作相应组织的替代物和支架材料的细胞外基质。体内诸多组织器官的构成和特性不尽相同，针对这些组织器官都有各自适合的脱细胞方案，目前脱细胞基质的研究多见于真皮、血管、膀胱等组织和器官，对于中枢神经组织(包括大脑、小脑、脑干、延髓)的脱细胞基质制备还鲜有报道。
[0004]组织的种类、来源、脱细胞方法和消毒灭菌方法都会对ECM造成影响。脱细胞的目标是有效去除细胞和细胞核成分，同时使任何的副反应减小到最小，保留ECM的机械完整性。目前常用的脱细胞方法包括基于物理作用的冻融、压力处理法；基于酶的核酸酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶处理法；基于化学作用的Triton X_100、SDS、乙酸、氨水处理法等。这些方法均有较大的不足:冻融、压力处理容易使ECM发生大量断裂；各种酶处理容易破坏ECM的超微结构并且酶难以从产品中去除；各种洗涤剂和酸碱同样容易破坏超微结构，并且可能损伤ECM胶原、糖胺聚糖(GAG)和生长因子，各种有毒洗涤剂和酸碱试剂的使用也给后续的移植带来隐患。这些问题在处理组织柔软、结构疏松，质地脆的中枢神经组织时更为明显。
【发明内容】
[0005]为解决上述问题，发明人提供了一种脱细胞脑组织三维支架，其是通过使用碱性去离子水处理脑组织获得。
[0006]本发明中的“碱性去离子水”是指使用NaOH将pH调至9_10的去离子水。
[0007]—方面，本发明提供了一种脱细胞脑组织三维支架，其是通过使用碱性溶液处理大鼠脑组织获得。
[0008]进一步的方面，使用的碱性溶液为碱性去离子水。
[0009]进一步的方面，具体制备步骤为:
[0010]原材料的获取:
[0011]取大鼠，深度麻醉处死，在两分钟内取出整个脑组织，在取出过程中，用PBS (0.0lM ；pH7.2?7.4)始终保持脑组织表面湿润；
[0012]脱细胞处理:
[0013]用去离子水清洗脑组织标本3次，移至玻璃制培养皿中，加入碱性去离子水(pH9-10);每30分钟更换新鲜碱性去离子水以保证培养皿中的液体清亮透明；待原材料完全呈透明状后，使用PBS(0.0lM ;pH7.2?7.4)清洗3次，每次10分钟；100Kunitz units DNA酶(I型DNase)处理I小时，PBS (0.0lM ；pH7.2?7.4)再次清洗3次，每次10分钟；整个脱细胞处理过程在脱色摇床上室温下进行(60-80r/min);
[0014]交联处理:
[0015]将经上述处理的脑组织组织标本移至预先配置好京尼平溶液中室温下交联48小时；
[0016]消毒:
[0017]在脱色摇床上(60rmp)使用PBS(0.0lM ;pH7.2?7.4)清洗交联过的脑组织标本3次，每次3分钟；将清洗后的脑组织标本投至1%。PAA中消毒6小时后，在脱色摇床上(60rmp)使用无菌PBS (0.0lM ;ρΗ7.2?7.4)再次清洗3次，每次3分钟；得到的产品在4°C下，无菌PBS溶液内保存。
【附图说明】
[0018]图1:按照本发明的方法制备的脱细胞脑组织三维支架肉眼观察图，左为新鲜脑组织，中为脱细胞处理后的脑组织，右为脱细胞处理后的脑组织透明度示意图。
[0019]图2:按照本发明的方法制备的脱细胞脑组织三维支架普通HE组织片染色(20Χ)，左为正常脑组织，右为支架。
[0020]图3:按照本发明的方法制备的脱细胞脑组织三维支架扫描电镜图，左为500倍，右为8000倍(联合种子细胞3D培养实验)。
[0021]图4:按照本发明的方法制备的脱细胞脑组织三维支架透射电镜图，13500倍。
[0022]图5:按照本发明的方法制备的脱细胞脑组织三维支架甲苯胺蓝髓鞘成分染色图，左图为正常大脑组织，右图为脱细胞处理所得支架。
[0023]图6:对照I方法制备的脱细胞脑组织三维支架外观图，左图为氨水处理4小时，右图为氨水处理24小时。
[0024]图7:对照2方法制备的脱细胞脑组织三维支架外观图。
[0025]图8、9和10:对照3方法制备的脱细胞脑组织三维支架外观、普通HE组织片染色、甲苯胺蓝髓鞘成分染色图，左为正常脑组织，右为脱细胞处理后的支架。
[0026]图11:对照4方法制备的脱细胞脑组织三维支架扫描电镜图，左为1000倍，右为10000 倍。
[0027]图12和13:对照5方法制备的脱细胞脑组织三维支架普通HE组织片染色图和外观图，左为正常脑组织，右为脱细胞处理后的支架。
[0028]图14:残留DNA含量检测电泳图。
【具体实施方式】
[0029]实施例1本发明脱细胞脑组织三维支架制备方法:
[0030]原材料的获取:
[0031]取大鼠(性别不限，体重?280g)，深度麻醉处死，在两分钟内取出整个脑组织，取出过程中尽可能避免锐利的硬脑膜及周围骨赘残端损伤中枢神经组织；在取出过程中，用PBS(0.0lM ；pH7.2?7.4)始终保持脑组织表面湿润；取出后直接开始脱细胞处理，也可以40CT PBS (0.0lM ；pH7.2?7.4)中储存(但储存时间不能超过24小时)；
[0032]脱细胞处理:
[0033]整个脱细胞处理过程在脱色摇床上室温下进行(60-80r/min);用去离子水清洗脑组织标本3次，移至玻璃制培养皿中(直径约8-lOcm)，加入碱性去离子水(pH 9-10);每30分钟更换新鲜碱性去离子水以保证培养皿中的液体清亮透明；待原材料完全呈透明状后(这一过程时间根据标本体积而定，2 X 5 X 5mm大小体积需要约3小时，整个小脑需要约30小时，大脑半球需要约70小时)，使用PBS (0.0lM ;pH7.2?7.4)清洗3次，每次10分钟；100Kunitz units DNA 酶(I 型 DNase 美国，Sigma-Aldrich 公司)处理 I 小时，PBS (0.0lM ；pH7.2?7.4)再次清洗3次，每次10分钟；
[0034]交联处理:
[0035]整个交联过程在室温下进行；将经上述处理的脑组织组织标本移至预先配置好京尼平(genipin，0.5%，日本，Wako公司)溶液中交联48小时(标本由白色变成蓝色)。
[0036]消毒:
[0037]使用PBS (0.0lM