>[0043] 4)加 GM-CSF 抗体 100 yL (按 0.25 yg、0.5 yg、0.75 yg、1.0 yg进行倍比 稀释)。
[0044] 5)同时设阴性对照孔、非特异性吸附孔(用PBS缓冲液代替含有目的蛋白的Hela 细胞)，37 °C反应1 h ;弃反应液，洗涤6次，每次5 min。
[0045] 6)加羊抗鼠 IgG-HRP (1:5000稀释)，每孔100 μ L，37 °C反应lh ;弃反应液，洗 涤6次，每次5 min。
[0046] 7)加 TMB 底物液，每孔 150 yL，37°C反应 25 min 8)加2 Μ硫酸终止反应；0D45。读数。
[0047] 9)判断标准为P/N值彡2，[ (P-P空白孔）ΛΝ_Ρ空白孔）]彡2判定为阳性。其中：P 为阳性孔的〇D45。读数，N为阴性孔的0D 45。读数。
[0048] 生长抑素标准曲线的建立 1)包被生长抑素抗原每孔 〇 μ g/μ L、0.1 μ g/μ L、0.2 μ g/μ L、0.4 μ g/μ L、0.8 μ g/μ L。每个样3个重复、4 °C过夜，弃反应液，洗涤6次，每次5 min。
[0049] 2)加封闭液(含1% BSA的PBS)200 μ!7孔，37 °C反应1 h后，洗涤6次，每次5 min〇
[0050] 3)加待生长抑素抗体100 yL (按1:300 ;1:600 ;1:900 ;1:1200进行倍比稀释)， 同时设阴性对照孔、非特异性吸附孔(用PBS缓冲液代替一抗)，37 °C反应1 h;弃反应液， 洗涤6次，每次5 min。
[0051] 4)加羊抗兔IgG-HRP (1:1000稀释)，每孔100 μ L，37 °C反应1 h;弃反应液，洗 涤6次，每次5 min。
[0052] 5)加 TMB 底物液，每孔 150 μ L，37 °C反应 25 min。
[0053] 6)加2 Μ硫酸终止反应；0D45。读数。
[0054] 7)通过用标准抗原建立生长抑素的标准曲线，得到生长抑素的标准曲线公式为： Y=0. 0878X (R2 =0. 97)，其中Y轴为生长抑素的含量，X轴为添加的生长抑素抗原的量。
[0055] 采用间接ELISA方法检测总蛋白中的生长抑素蛋白 1)以含有生长抑素蛋白的总Hela蛋白以（0.25 yg、0.5 yg、l yg、2 yg、4 yg、8 yg、16 yg、32 yg、64 yg、128 yg)用包被液，4 °C过夜。
[0056] 2)弃反应液，洗涤6次，每次5 min。
[0057] 3 )加封闭液(含1 %BSA的PBS ) 200 μ L/孔，37 °C反应1 h后，洗涤6次，每次5 min〇
[0058] 4)加生长抑素抗体100 yL (按1:300 ;1:600 ;1:900 ;1:1200进行倍比稀释)。
[0059] 5)同时设阴性对照孔、非特异性吸附孔(用PBS缓冲液代替含有目的蛋白的Hela 细胞)，37 °C反应1 h ;弃反应液，洗涤6次，每次5 min。
[0060] 6)加羊抗兔IgG-HRP (1:1000稀释)，每孔100 μ L，37 °C反应lh ;弃反应液，洗 涤6次，每次5 min。
[0061] 7)加 TMB 底物液，每孔 150 μ L，37 °C反应 25 min 8)加2 Μ硫酸终止反应；0D45。读数。
[0062] 9 )判断标准为P/N值彡2，[ (P-P空白孔）ΛΝ-Ρ空白孔）]彡2判定为阳性。
[0063] 10)生长抑素标准曲线来判定生长抑素蛋白的含量。
[0064] 共表达基因疫苗PIRES-GM-CSF/2SS的制备及实施 3. 1 pIRES-GM-CSF/2SS基因疫苗的制备 对构建的PIRES-GM-CSF/2SS基因疫苗进行大量提取并去除内毒素，进行鉴定，正确后 可以用于动物实验。
[0065] 质粒的大量提取及内毒素的去除 从37 °C培养12-16 h的平板中以无菌操作挑取一个单菌落。37 °C摇床过夜，接种至 含有300 mL LB培养基的500 mL烧瓶中，37 °C摇振12-16 h，移离心5 min(4 °C，8000 r/ min)。用苯酸/氯仿/异戊醇抽提质粒，再加入等体积的PEG-MgC12溶液纯化质粒。
[0066] 加入1/5体积的预冷的内毒素清除溶液(如500 μ L待处理液体样本中加入100 yL内毒素清除溶液)。振荡均匀，将离心管置于冰水浴10 min，溶液应为均一、清亮。
[0067] 将管子置于37 °C水浴箱中保温20-30 min，期间不时振荡数次，直至离心管中的 液体分成两相，极大部分内毒素被浓缩在下层油状相中。室温12, 000 r/min离心2 min。 溶液分成上下两层。将含DNA的上层水相转移到新管中，弃掉下层油状相。重复两次。
[0068] 最后吸取的DNA液转入到一个新管中，补加1/10体积的3M乙酸钠 （pH 5. 2)和2 倍体积的无水乙醇。-20 °C冻存30 min或过夜，12, 000 r/min离心10 min。弃去上清液， 加入1 mL70 %乙醇轻轻洗涤，12000 r/min离心2 min，小心弃去液体，室温倒置凉干5 min。 加入500 μ L无内毒素的灭菌生理盐水溶解沉淀的DNA，备用。
[0069] 质粒的鉴定 1. 〇 %琼脂糖凝胶电泳鉴定。抽提的质粒用船el和此oRI、AbiI和5^1双酶切，酶切 体系 1:质粒 12 μL、Λ*??Ι 0.1 yL 和方coRI 0.3 yL、10XH Buffer 2yL、dd H20 4.6 PL。酶切体系 2:质粒 12 yL、AbiI 0.2 yL和免乃 0.2 yL、10XHBuffer 2 yL、dd H20 4. 6 μ L，37°C，反应2-3 h，1. 0 %琼脂糖凝胶电泳鉴定。
[0070] 佐剂DDA的制备 双十八烷基二甲基溴化铵（dimethyl-dioctyldecylammonium bromide，DDA)，粉末状 的DDA分装后，用pH 7. 2的NaCl稀释，然后将其置于80 °C水浴锅中加热5 min，反复摇 匀20 min左右。冷却室温备用，DDA的作用类似于微胶囊，能缓慢释放所包裹的质粒载体， 从而延长抗原表达时间。
[0071] 基因疫苗的实施 进行猪半腱肌注射免疫，首先注射〇. 5%盐酸利多卡因2mL，半小时后注射质粒，采用2 次免疫注射的方法，第一次免疫加入350 μ g DDA佐剂，15 d后同样剂量加强免疫1次，但不 加入DDA佐剂。实验证明，仔猪0. 25 mg/头为适宜剂量。
【主权项】
1. 一种促进畜禽生长的GM-CSF基因与SS基因共表达DNA疫苗pIRES-GM-CSF/2SS的 方法，其特征在于：具体步骤如下： A、 将pIRES质粒用觔e I和及I进行双酶切，以pVGS/2ss-asd质粒为模板， PCR获取猪GM-CSF基因，胶回收GM-CSF基因与T载体进行连接反应，构建阳性重组质粒 pIRES-GM-CSF ； B、 以pVGS/2ss-asd质粒为模板，用船e I和历>^ III进行双酶切，PCR获取猪SS基因， 用Abt I和SaJ I进行双酶切与T载体进行连接反应，构建T2SS质粒； C、 采用Abfl和免乃内切酶分别酶切pIRES-GM-CSF质粒和T2SS质粒，将纯化、回收的 pIRES-GM-CSF大片段和2SS片段进行连接反应，构建真核表达质粒pIRES-GM-CSF/2SS，得 到 DNA 疫苗 pIRES-GM-CSF/2SS。
【专利摘要】本发明公开了一种促进畜禽生长的GM-CSF基因与SS基因共表达DNA疫苗pIRES-GM-CSF/2SS的方法，涉及动物医药生物工程领域。该方法是选择共表达载体pIRES，将GM-CSF与SS基因分别插入pIRES？载体的MCS？A和MCS？B两个多克隆位点，构建GM-CSF基因与SS基因共表达DNA疫苗。pIRES-GM-CSF/2SS疫苗采用一次注射，它能同时表达出SS和GM-CSF两个完全独立的GM-CSF和SS蛋白，它利用基因佐剂GM-CSF对生长抑素基因疫苗进行免疫调节，从而减少了工作量及对免疫动物的应激影响，能保持独立的免疫原性，增强了免疫效果。该疫苗可作促进畜禽生长用。
【IPC分类】A61K48/00, A61K39/00, A61P37/04, C12N15/66, C12N15/85
【公开号】CN105233305
【申请号】CN201510734979
【发明人】舒邓群, 张国生, 魏金钢, 兰方菲
【申请人】江西农业大学
【公开日】2016年1月13日
【申请日】2015年11月3日