司动物培养实验室)随机分为4组，每组42只，公母各半。第一组:空白对照组，即不进行任何处理；第二组:仅注射0型口蹄疫灭活疫苗组；第三组:太子参为主料的中药提取物佐剂疫苗组，即注射实施例2制备的太子参为主料的中药提取物佐剂0型口蹄疫灭活疫苗；第四组:不完全弗氏佐剂疫苗组，即注射实施例2制备的不完全弗氏佐剂0型口蹄疫灭活疫苗。采用肌肉注射方法免疫小鼠，且第二组、第三组和第四组的注射量均为0.3 mL/只，一免后15 d每组取14只小鼠进行眼球采血，6000 rpm / min离心10 min分离出血清，检测抗体效价；剩余小鼠进行二次免疫，二免后15 d每组取14只进行眼球采血，分离出血清，检测抗体效价；14只于二免后15 d眼球采血，分离出血清，检测抗体效价。血清抗体效价测定进行间接ELISA检测。结果见图1。
[0021]实施例4
以实施例2制备的太子参为主料的中药提取物佐剂0型口蹄疫多肽疫苗与不完全弗氏佐剂0型口蹄疫多肽疫苗进行对比试验:
将168只昆明系小鼠(培养于福建贝迪药业有限公司动物培养实验室)随机分为4组，每组42只，公母各半。第一组:空白对照组，即不进行任何处理；第二组:仅注射0型口蹄疫多肽疫苗组；第三组:太子参为主料的中药提取物佐剂疫苗组，即注射实施例2制备的太子参为主料的中药提取物佐剂0型口蹄疫多肽疫苗；第四组:不完全弗氏佐剂疫苗组，即注射实施例2制备的不完全弗氏佐剂0型口蹄疫多肽疫苗。采用肌肉注射方法免疫小鼠，且第二组、第三组和第四组的注射量均为0.3 mL/只，一免后15 d每组取14只小鼠进行眼球采血，6000 rpm / min离心10 min分离出血清，检测抗体效价；剩余小鼠进行二次免疫，二免后15 d每组取14只进行眼球采血，分离出血清，检测抗体效价；14只于二免后15 d眼球采血，分离出血清，检测抗体效价。血清抗体效价测定进行间接ELISA检测。结果见图2。
[0022]实施例5
以实施例2制备的太子参为主料的中药提取物佐剂0型口蹄疫DNA疫苗与不完全弗氏佐剂0型口蹄疫DNA疫苗进行对比试验:
将168只昆明系小鼠(培养于福建贝迪药业有限公司动物培养实验室)随机分为4组，每组42只，公母各半。第一组:空白对照组，即不进行任何处理；第二组:仅注射0型口蹄疫DNA疫苗组；第三组:太子参为主料的中药提取物佐剂疫苗组，即注射实施例2制备的太子参为主料的中药提取物佐剂0型口蹄疫DNA疫苗；第四组:不完全弗氏佐剂疫苗组，即注射实施例2制备的不完全弗氏佐剂0型口蹄疫DNA疫苗。采用肌肉注射方法免疫小鼠，且第二组、第三组和第四组的注射量均为0.3 mL/只，一免后15 d每组取14只小鼠进行眼球采血，6000 rpm / min离心10 min分离出血清，检测抗体效价；剩余小鼠进行二次免疫，二免后15 d每组取14只进行眼球采血，分离出血清，检测抗体效价；14只于二免后15d眼球采血，分离出血清，检测抗体效价。血清抗体效价测定进行间接ELISA检测。结果见图3。
[0023]实施例6
以实施例2制备的太子参为主料的中药提取物佐剂鸭疫里氏杆菌减毒疫苗与不完全弗氏佐剂鸭疫里氏杆菌减毒疫苗进行对比试验。
[0024]将72羽健康72日龄试验鸭(由福建贝迪动物药品厂动物饲养场提供)随机分为4组，每组18羽。第一组:空白对照组，即不进行任何处理；第二组:仅注射鸭疫里氏杆菌减毒疫苗组；第三组:太子参为主料的中药提取物佐剂疫苗组，即注射实施例2制备的太子参为主料的中药提取物佐剂鸭疫里氏杆菌减毒疫苗；第四组:不完全弗氏佐剂疫苗组，即注射实施例2制备的不完全弗氏佐剂鸭疫里氏杆菌减毒疫苗。且第二组、第三组和第四组的注射量均为1 mL /羽。采用颈部皮下注射方法免疫鸭子，一免后15 d每组取6只鸭子进行颈静脉采血，6000 rpm / min离心10 min分离出血清，检测抗体效价。剩余鸭子进行二次免疫，二免后15 d每组取6只进行颈静脉采血，分离出血清，检测抗体效价；6只于二免后15 d颈静脉采血，分离出血清，检测抗体效价。血清抗体效价测定进行间接ELISA检测。结果见图4。
[0025]从图1-4可以看出:在免疫小鼠时，第一组，即不进行任何处理时，效价极低，几乎检测不到；太子参为主料的中药提取物做免疫佐剂，分别与减毒疫苗、灭活疫苗、多肽疫苗或DNA疫苗进行体积比1:20混合，免疫小鼠和鸭，小鼠和鸭不仅能健康成长，且其体内抗血清检测发现小鼠抗血清中较长时间内可检测到高滴度抗体，与对照组不完全弗氏佐剂做免疫佐剂对比，两者之间不存在显著差异。因此，太子参为主料的中药提取物可作为主要有效成分用于制备免疫佐剂，即太子参为主料的中药提取物可用于制备免疫佐剂，是一种可以增强抗原免疫保护效果的安全有效的疫苗佐剂。可应用于传统的减毒疫苗、灭活疫苗、DNA疫苗和多肽疫苗的免疫保护中。
【主权项】
1.一种疫苗佐剂，其特征在于:其有效成分为太子参为主料的中药提取物，所述太子参为主料的中药提取物按下述步骤制备而得: (i)、干燥和粉碎:将太子参、淫羊藿、黄芪和灵芝分别进行干燥后，以质量比计，按太子参:淫羊藿:黄芪:灵芝=5-7: 0.5-1.5: 1.5-2.5: 0.5-1.5的固定比例混合并粉碎； (ii)、超声预处理:将步骤(i)获得的中药粉按固液比g/ml=l:10-1:30加入乙醇进行超声； (iii)、低温超临界C02萃取:将步骤(ii)超声后获得的中药乙醇分散液进行烘干后，再在夹带剂存在的条件下进行低温超临界C02萃取，萃取操作参数为:夹带剂占总萃取溶剂的体积百分比为1_3%，萃取温度35-50°C，萃取压力10-25MPa，C(V流量2_4L/h，萃取时间0.5-2h;所述夹带剂为乙醇、乙二醇、丙酮和乙酸乙酯中的一种或多种；待萃取结束后，减压回收夹带剂，即得太子参为主料的中药提取物。2.如权利要求1所述的疫苗佐剂，其特征在于步骤(i)中:干燥至水分的质量百分含量不高于10% ;粉碎目数为65-80目。3.如权利要求1所述的疫苗佐剂，其特征在于步骤(ii)中:乙醇为体积纯度为85%以上的乙醇；超声时的参数为:超声功率50-200 W，超声频率20-40 kHz，超声时间30_50min。4.如权利要求1所述的疫苗佐剂，其特征在于步骤(iii)中:烘干时的温度为60-80°C，夹带剂的体积纯度为80-100% ;若夹带剂为多种时，等体积比混合使用。5.利用如权利要求1-4之任一所述疫苗佐剂制成的佐剂疫苗，其特征在于:将疫苗佐剂先与无菌去离子水按体积比1:5-10混匀，获得疫苗佐剂稀释液；再将疫苗佐剂稀释液直接和疫苗混合，即制得佐剂疫苗；其中所述疫苗佐剂在制备得到的佐剂疫苗中所占的体积比为 2.5-8%ο6.如权利要求5所述的佐剂疫苗，其特征在于:所述疫苗为减毒疫苗、灭活疫苗、多肽疫苗或DNA疫苗。7.如权利要求6所述的佐剂疫苗，其特征在于:所述疫苗为鸭疫里氏杆菌减毒疫苗，0型口蹄疫灭活疫苗，0型口蹄疫多肽疫苗或0型口蹄疫DNA疫苗。
【专利摘要】本发明属于医药与医学工程技术领域，涉及一种疫苗佐剂及利用其制成的佐剂疫苗。其有效成分为太子参为主料的中药提取物，按下述步骤制得：（i）、将太子参、淫羊藿、黄芪和灵芝分别进行干燥后粉碎；（ii）、将步骤（i）获得的中药粉按固液比g/ml=1:10-1:30加入乙醇进行超声；（iii）、将步骤（ii）超声后获得的中药乙醇分散液进行烘干后，再在夹带剂存在的条件下进行低温超临界CO2萃取，萃取操作参数为：夹带剂占总萃取溶剂的体积百分比为1-3%，萃取温度35-50℃，萃取压力10-25MPa，CO2流量2-4L/h，萃取时间0.5-2h；所述夹带剂为乙醇、乙二醇、丙酮和乙酸乙酯中的一种或多种。本发明疫苗佐剂，用于免疫小鼠和鸭，小鼠和鸭不仅能健康成长，且其体内抗血清中较长时间内可检测到抗体。
【IPC分类】A61P31/04, A61K39/02, A61K39/39, A61K48/00, A61P31/14, A61K39/135
【公开号】CN105288615
【申请号】CN201510720809
【发明人】赵军, 肖建设, 潘慧青, 张炎达, 杨荣平, 史金慧, 林贺桂, 邓翠芬, 赵清国, 李晓航, 赵齐
【申请人】福建贝迪药业有限公司, 郑州贝迪生物科技有限公司
【公开日】2016年2月3日
【申请日】2015年10月30日