果A>B>C，即影响包合的因素排列顺序为：挥 发油与β-⑶的质量比〉包合时间〉加水量。A 3B3C2为最佳因素水平组合。以D项作为误 差项，进一步进行方差分析，结果见表14。
[0125] 表14.以挥发油利用率为指标的方差分析表
[0129] 查F检验临界值结果Fa(]5 (2, 2) = 19. 00,各因素对实验结果的影响均不显著，包 合最佳因素组合为A3B3C2，即挥发油与β -⑶的质量比1 :4、包合时间20min、加水量4倍。
[0130] 以包合物含油率为指标，极差分析结果A>B>C，即影响包合的因素排列顺序为：挥 发油与β-⑶的质量比〉包合时间〉加水量。A 1B3C2为最佳因素水平组合。以D项作为误 差项，进一步进行方差分析，结果见表15。
[0131] 表15.以含油率为指标的方差分析表
[0134] 查F检验临界值结果Fi1id5 (2, 2) = 19.00, A因素对实验结果有显著性，其他各因 素对实验结果的影响均不显著，包合最佳因素组合为A1B3C 2，即挥发油与β-⑶的质量比1 : 8、包合时间20min、加水量4倍。
[0135] 为了更加客观地评价，用综合评分寻找最佳工艺，计算方法如下：在挥发油包合物 的2个指标中，分别选取最高者作为100分，然后对2个指标赋与不同的权重，考虑到生产 成本，将挥发油利用率的权重定为〇. 6,包合物含油率的权重定为0. 4,按计算公式：综合得 分为
结果表明：极差分析结果A>B>C，即影响包合的因 素排列顺序为：挥发油与β -⑶的质量比〉包合时间〉加水量。A3B3C2为最佳因素水平组 合。以D项作为误差项，进一步进行方差分析，结果见表16。
[0136] 表16.以综合评分为指标的方差分析表
[0140] 查F检验临界值结果Fa(]5 (2, 2) = 19. 00,各因素对实验结果的影响均不显著，但 其F值远比单指标考察时低得多，包合最佳因素组合为A3B 3C2，即挥发油与β -⑶的质量比 1 :4、包合时间20min、加水量4倍。
[0141] (2)挥发油包合追加验证试验
[0142] 为了验证上述结果，选用A3B3C2，即挥发油用等量乙醇溶解后，挥发油与β -⑶的 质量比1 :4、包合时间20min、加水量4倍条件下进行挥发油包合追加验证试验,看看选定条 件与原来的试验结果是否吻合，验证结果为三批产品平均挥发油利用率92. 31 %，平均包合 物含油率为8. 797%。
[0143] 因此，挥发油β -环糊精包合追加验证试验结果与前述试验结果基本吻合，因此 将挥发油用等量乙醇溶解后，挥发油与β -⑶的质量比1 :4、包合时间20min、加水量4倍确 定为最佳挥发油β-环糊精包合工艺条件。
[0144] (3)包合物制备方法
[0145] 按照正交表的安排，将一定量的挥发油用等量乙醇溶解后，取一定量的β-CD，加 入规定倍量的水研匀，倒入胶体磨中，开动机器，缓慢连续滴加与等量无水乙醇溶解的挥发 油，碾磨一定时间，于40°C真空干燥24小时，40°C回风干燥，即得包合物。
[0146] (4)考察挥发油包合物的指标计算公式与方法
[0147] ①挥发油的密度测定
[0148] 照《中国药典》2010年版一部附录W A相对密度测定法测定.
[0149] 比重瓶法：测得挥发油密度为P = I. 0683g/ml
[0150] ②挥发油空白回收率的测定精密量取挥发油Iml置于250ml圆底烧瓶中，加蒸馏 水100ml，按照《中国药典》2010年版附录XD.挥发油测定法（一法）平行测定三次，结果 平均空白回收率为92. 7%，并依此法测定包合物实际挥发油含油量。
[0151] ③考察包合工艺试验指标计算公式：
[0155] ④包合物的表征：
[0156] 为了确定挥发油是否包合，采用UV扫描（190-600nm)，进行四个样品的比较： β -环糊精、包合物、挥发油、β -环糊精与挥发油油的物理混合物。选择无水乙醇作溶剂UV 扫描图谱。包合后300nm左右吸收峰消失，而物理混合物、挥发油中均含有此峰。
[0157] (四）浓缩与干燥条件的优选实验
[0158] 由于本处方药材中含有多糖成分，多糖在热醇中有一定的溶解度，难以干燥，清膏 干燥后，比较黏，容易吸潮，也不利于胶囊填充，为方便工业化生产，需要对浓缩工艺条件以 及方式进行优选，在测定清膏的固形物得率后，通过大量的创造性调配实验添加部分微晶 纤维素混匀，再干燥，以提高干燥速率，降低干膏的黏度，以利于后续生产，结果见表17。
[0159] 表17.浓缩、干燥试验结果
[0161] (五）硬胶囊剂成型工艺研究
[0162] ①填充剂的确定：中药浸膏得率会因原药材及生产工艺等因素上下浮动，同时本 品浸膏吸潮性较强，故辅料的选择不仅考虑调节装量，亦要考虑降低浸膏易吸湿性，以及其 他属性。
[0163] ②润滑剂的确定：考虑胶囊填充，选硬脂酸镁作为润滑剂，通过测定颗粒的休止角 确定其用量。
[0164] ③崩解剂的确定：通过胶囊填充以后，测定崩解时限来确定是否需添加崩解剂以 及用量。
[0165] 通过不同处方的筛选实验，以干膏的吸湿性、粉末的流动性、胶囊的崩解时限来进 行处方辅料的组成筛选，选用淀粉、糊精和微晶纤维素常用的填充剂作为筛选对象，经对比 试验，综合考虑微晶纤维素较淀粉和糊精更易于成型，故选择微晶纤维素作为填充剂。硬 脂酸镁可以明显改善粉末的流动性，〇. 5%和1%的硬脂酸镁对流动性的改善幅度不大，考 虑到硬脂酸镁的疏水性特性，故将润滑剂的用量确定为〇. 5%。经测定本品自身崩解性能较 好，故无需再添加崩解剂。结果见表18-24。
[0166] 表18.干膏吸湿性实验结果
[0167]
[0168] 表19.润滑剂用量实验结果
[0170] 3、处方的确定
[0171] 通过处方的筛选可以看出加入微晶纤维素和硬脂酸镁不仅能够改善浸膏粉的黏 性，其流动性也能够改善，综合考虑确定制剂处方如下：
[0172] ①处方
[0174] ②制法：
[0175] 取预先加入部分微晶纤维素的浸膏加入包合物混合均匀，用万能粉碎机粉碎，过 100目筛，再加入剩余微晶纤维素和〇. 5%硬脂酸镁混合均匀，以0号胶囊填充，每粒装量 0. 5g，即得。
[0176] 为了进一步验证筛选结果，按上述处方进行验证试验，结果测得平均休止角32°， P平均崩解时限14. 5min。·
[0177] (六）、中试研究
[0178] 为了验证试验结果在大生产中的可行性，按照前述确定的工艺进行六批批中试， 结果见表24-28。
[0179] 表20.六批超临界萃取中试数据表
[0181] 表21.六批包合中试数据表
[0183] 表22.六批醇提、干燥中试数据表
[0186] 表23.六批混合、粉碎中试数据表
[0188] 表24.六批混合、胶囊填充、分装中试数据表
[0190] 对本发明中药组合物（以下称复方银灵通胶囊）促进中风后恢复功能进行药效学 实验，具体阐述如下：
[0191] 一、试验材料
[0192] 1、药品与试剂
[0193] 受试药名称：复方银灵通胶囊（按照实施例1方法制备得到，其中每重量份取 Ig)，人用量：6. Og浸膏粉末/人.d、成人服用生药材量：18. 168g，每克浸膏粉末相当于 生药3. 028g。配制方法：将受试药用0. 5% CMC-Na研磨配制成所需浓度的均匀混悬液。
[0194] 银杏叶片：扬子江药业集团有限公司，规格：每片含总黄酮醇苷19. 2mg，萜类内酯 4. 8mg，批号：12053121。药物配制：临用前用0. 5% CMC-Na研磨配制成所需浓度的均匀混 悬液。
[0195] 阿司匹林肠溶片：拜耳医药保健有限公司，规格：100mg，临用前用0. 5% CMC-Na研 磨配制成所需浓度的均匀混悬液。
[0196] 水合氯醛：国药集团化学试剂有限公司，临用前用0.9%氯化钠注射液配制成浓 度为3%的溶液。
[0197] 红四氮唑（TTC)，国药集团化学试剂公司产品，临用前称取TTC粉末，用磷酸盐缓 冲液溶解配制成1 %的TTC溶液。
[0198] 甲醛溶液：A. R，西陇化工股份有限公司产品，规格：500ml/瓶，批号：1005152。
[0199] 血小板活化因子（PAF) :SIGMA公司产品。
[0200] 配制：①取PAFlmg，置于2. 6ml氯化钠注射液中使溶解，分装于具塞密封管中 0.1 ml/支，-20°C保存，临用前以氯化钠注射液100倍稀释备用（浓度为7. 072 μ mol/L)。② 取PAF5mg，用DMSO溶解配制为母液，-20°C保存。临用前用灭菌PBS稀释至所需浓度（作 用于神经元的终浓度为40 μ mol/L)。
[0201] 5 '-腺苷二磷酸二钠盐（ADP) :SIGMA 公司，批号：YY1124B056W。
[0202] 配制：①取IOmg ADP，置6. 64ml 0. 9 %氯化钠注射液中，震荡至完全溶解，先配成 3mmol/L的保存液，分装于具塞密封管，0.1 ml/支，-20°C保存。临用前以0. 9%氯化钠注射 液稀释10倍即可（浓度为300 μ mol/L)。②取400mg ADP，用生理盐水配成20mg/ml的溶 液。
[0203] MEM培养基：美国GIBCO公司，批号：1133365。取MEM粉末溶于1000 ml灭菌三蒸 中，用NaHC03调pH值至7. 0,过滤除菌、分装，4°C冰箱保存。使用前加入10%胎牛血清。
[0204] 无糖 EBSS (Earle，s balanced salt solution)缓冲液：称取 NaCl 6. 8g、NaHCO3 2. 2g、KCl 0· 4g、CaCl2 · 2H20 0· 265g、MgSO4 0· 09767g、NaH2PO4 0· 122g，溶于 1000ml 三蒸 水中，pH7. 2-7. 4,过滤除菌，4°C冰箱保存。
[0205] 含糖 EBSS 缓冲液：称取 NaCl 6. 8g、NaHCO3 2. 2g、KCl 0· 4g、CaCl2 · 2H20 0· 265g、 MgSO4 0· 09767g、NaH2PO4 0· 122g、葡萄糖 lg，溶于 1000ml 三蒸水中，ρΗ7· 2-7. 4,过滤除 菌，4°C冰箱保存。
[0206] 消化液：胰酶，BI0SHARP公司产品；胰酶用PBS配至0. 25%，过滤除菌；EDTA用PBS 配至0. 02 %，高压灭菌。胰酶、EDTA I : 1混合，4°C冰箱保存。
[0207] β-actin，山羊抗兔（抗小鼠）IgG,:北京博奥森生物技术有限公司产品。
[0208] Syn 抗体，NF- κ B p65 抗体，NF- κ B pp65 抗体：Ι κ B α 抗体，ρ? κ B α 抗体均为 Santa Cruz Biotechnology 公司产品。
[0209] 2、试验动物
[0210] 雄性清洁级SD大鼠，体重250~300g，苏州工业园区爱尔麦特科技有限公司提供， 生产许可证号：SCXK (苏）2009-0001 ;白色家兔，体重I. 8-2. 0kg，由南京市江宁区青龙山动 物繁殖场提供，动物生产许可证号=SCXK (苏）2012-0008。
[0211] 二、实验方法与结果：
[0212] 1、复方银灵通胶囊治疗给药对大鼠大脑中动脉闭塞再灌注所致脑损伤的保护作 用（第一天给药3次，以后每天给药一次，连续给药14天）
[0213] I. 1对死亡率、神经行为学评分、脑含水量、梗塞率的影响
[0214] 清洁级雄性SD大鼠105只，体重250_300g，采用线栓法制备大鼠大脑中动脉闭塞 (MCAO)模型[1]。伪手术组大鼠除不插入线栓外，其他操作同模型组。造模后将动物分为7 组，每组15只，复方银灵通胶囊3个剂量组,分别为：1. 2g/kg(0. 24g/ml) ,0. 6g/kg(0. 12g/ ml)，0· 3g/kg(0· 06g/ml)。阳性对照药银杏叶提取物组4mg/kg(0· 8mg/ml)。另设伪手术组 及缺血模型对照组（均给以等容积的0. 5% CMC-Na)。于复灌后3h开始灌胃给药，每天给 药一次，总共给药15天，首次给药剂量为维持量的3倍。
[0215] 实验过程中观察并记录动物的死亡情况（死亡前症状和死亡数）。即记录动物的 存活率。
[0216] 渔线的制备：将一长40mm，直径0. 26mm的渔线的一端用记号笔标记，在距离此标 记端18mm处用记号笔再做一标记，置于生理盐水中备用。
[0217] 于第一次给药后0. 5h始，隔天参照神经功能缺陷评分法（18分标准）对各组大鼠 进行评分[2]，标准如下：
[0218] 大鼠神经行为学评分标准
[0221] 上述指标测定后，将大鼠麻醉，测脑温，之后处死大鼠。取出大脑，迅速置于_20°C 速冻10-15min，至鼠脑变硬时，从额极2mm开始，做冠状均切五刀，后方至大脑与后脑交 界处，切成2mm厚的六片后迅速将脑片置于适量1% TTC的磷酸缓冲溶液中[气避光温孵 [气每隔7~8分钟翻动一次，不时观察脑片颜色变化，待红色区鲜明显现时取出脑片（约 30min)，用数码相机拍照后输入电脑，之后用Image pro plus计算梗塞区（白色）和两半 脑体积，计算梗塞百分比如下：
[0222] 脑梗死体积百分比={[总梗死体积_(右半脑体积-左半脑体积）]/左半脑体 积} X100%。
[0223] 将染色后的脑组织称得大脑湿重，然后置于IKTC烘箱烘干，对照大脑湿重求出脑 含水量如下 [5]:
[0224] 脑组织含水量（％) = (1-脑组织干重/脑组织湿重）X 100%
[0225] 结果见表25~表26。
[0226] 表25对局灶性脑缺血再灌注大鼠死亡率的影响（is,
[0229] 各组死亡率如上表所示。随银灵通剂量升高，大鼠死亡率有逐渐降低的趋势。
[0230] 表26对局灶性脑缺血再灌注大鼠神经行为学评分的影响(3封）
[0232] #p〈0. 05, ##p〈0. 01 模型对照组 vs.伪手术组；*p〈0. 05, **p〈0. 01 vs.模型对照组； ap〈0. 05, aap〈0. 01银灵通组vs.银杏叶片组；bp〈0. 05, bbp〈0. 01银灵通组vs.阿司匹林组
[0233] 由表26可见，伪手术组未见明显的神经行为学损伤。与伪手术组相比，模型组自 缺血后第一天开始，神经行为学评分均极显著性降低（p〈0. 01)。与模型对照组相比，银灵 通高剂量组能显著性升高缺血再灌注后第8d大鼠神经行为学评分（p〈0. 05)，能极显著性 升高缺血再灌注后第l〇d、12d、14d大鼠神经行为学评分（p〈0.01);银灵通中剂量组能显著 性升高缺血再灌注后12d大鼠神经行为学评分（p〈0. 05)，能极显著性升高缺血再灌注后第 14d大鼠神经行为学评分（p〈0.01)。银灵通各剂量组与银杏叶片组相比，银灵通低剂量组 第14d神经行为学评分显著性降低（p〈0. 05)。
[0234] 表27对局灶性脑缺血再灌注大鼠脑温、梗塞百分比及脑组织含水量的影响(?)
[0237] #p〈0. 05, ##p〈0. 01 模型对照组 vs.伪手术组；*p〈0. 05, **p〈0. 01 vs.模型对照组； ap〈0. 05, aap〈0. 01银灵通组vs.银杏叶片组；bp〈0. 05, bbp〈0. 01银灵通组vs.阿司匹林组
[0238] 由表27可见，缺血再灌注后第14d，各造模组脑温和脑含水量与伪手术组相比均 无显著性差异（P>〇. 05);缺血再灌注后14d，伪手术组未见明显的梗死区，模型对照组脑 梗塞百分比为41. 4±9. 8%，与模型对照组相比银灵通高剂量组脑梗塞百分比极显著性降 低（p〈0. 01)，为19. 5±6. 7% ;银灵通中剂量组脑梗塞百分比为29. 9±5. 5%，与模型对 照组相比显著性降低（P〈〇. 05);银杏叶片组和阿司匹林组脑梗塞百分比也极显著性降低 (ρ〈0·05)，分别为 16·6±4· 1%和 14·3±4·4%。
[0239] 与银杏叶片组相比，银灵通中、低剂量组脑梗塞百分比极显著性升高（ρ〈0.01); 与阿司匹林组相比，银灵通中、低剂量组脑梗塞百分比极显著性升高（ρ〈0. 01)。
[0240] 1. 2对学习记忆功能、局部脑血流量和脑组织病理学的影响
[0241] 另取雄性SD大鼠105只，造模及给药方法同上。于第14次给药后0. 5h(复灌后 第13d，采用Y型迷宫测定大鼠学习和记忆功能[￡]:将受试大鼠放入迷宫内适应Smin后，给 予电刺激，随机改变电击区和安全区，电击时大鼠径直逃避至安全区为正确反应，否则为错 误反应 [2]。学习成绩以在连续的10次电击中，正确反应达9次时的累计电击次数来表示； 学习成绩测定后24h，对大鼠连续电击10次，其中正确反应次数即为该大鼠的记忆成绩。而 后腹腔注射3%水合氯酸（300mg/kg)麻醉大鼠。用大鼠脑立体定位仪将大鼠头部固定，暴 露卢页骨，用齿科打磨器于前囟点右2mm/下2mm处钻一直径为2-3mm的骨窗（不能损伤硬脑 膜），将TSD144型激光多普勒探头置于骨窗中较粗血管的正上方，用脑立体定位仪固定探 头，连接MP150型十六导生理记录仪进行脑血流监测，待曲线平稳约15min后，记录平稳区 段的平均脑血流量 [2]。然后将大鼠处死，取出损伤侧脑于10%甲醛溶液中固定，由病理专 业人员制片，HE染色，并于光镜下阅片，观察大脑皮质海马区细胞形态学改变 [气
[0242] 表28对局灶性脑缺血再灌注大鼠学习记忆能力的影响土V)
[0245] #ρ〈0· 05, ##ρ〈0· 01 模型对照组 vs.伪手术组；*ρ〈0· 05, **ρ〈0· 01 vs.模型对照组； ap〈0. 05, aap〈0. 01银灵通组vs.银杏叶片组；bp〈0. 05, bbp〈0. 01银灵通组vs.阿司匹林组
[0246] 缺血再灌注后第13d进行学习能力测定，由表28可见，与伪手术组相比，模型对 照组大鼠学习次数极显著性增多