鲁卡因注射液局部浸润麻醉。剪开颈部皮肤约3cm，用止血钳进行钝性分离，暴露支 气管后分离出颈总动脉。细线结扎颈总动脉远心端，再用动脉夹夹闭近心端，进行血管插管 后固定。然后打开动脉夹，将血液放入含有3. 8%梓檬酸钠的试管中，使血液与3. 8%梓檬 酸钠容积之比为9:1。
[0329] 3. 3制备富血小板血浆（RPR)和贫血小板血浆（PPP)
[0330] 将上述制备的抗凝血液混匀后，500rpm离心10min后吸取上层血浆即得PRP ;将剩 余血液3500rpm离心10min后吸取上层血楽即得PPP。
[0331] 3. 4测定血小板聚集率[11]
[0332] 先取300 μ I PPP加入测试杯中，然后放入测试孔，按"PPP"键进行定标。然后取 270μ I PRP加入测试杯中，在37°C预温槽中预热3min后放入测试孔，按"开始"键时立即 加入诱导剂30 μ 1 (两种诱导剂的浓度分别为PAF7. 072 μ mol/L、ADP300mmol/L)，以测定最 大聚集率。每次测定4个通道，以求得平均最大聚集率。
[0333] 按下列公式计算血小板聚集抑制率：
[0335] 3. 5 结果
[0336] 3. 5. 1复方银灵通胶囊对PAF诱导家兔体外血小板聚集率的影响
[0337] 表38体内给复方银灵通胶囊对PAF诱导家兔体外血小板聚集率的影响丨J±S)
[0339] *ρ〈0· 05, **ρ〈0· 01 vs.空白对照组；ap〈0. 05, aap〈0. 01 vs.银杏叶片组；bp〈0. 05， bbp〈0. 01 vs.阿司匹林组
[0340] 由表38可见，与空白对照组相比，银杏叶片组能显著性抑制家兔体外血小板聚 集（P〈〇. 05)，银灵通高、中、低三个剂量组对PAF诱导的家兔血小板聚集有抑制作用，并 随剂量升高，其聚集抑制率呈剂量依赖性升高，其中银灵通高剂量组最大血小板聚集率 与空白对照组比较有显著性差异（P〈〇. 05)，阿司匹林组与空白对照组比较无显著性差异 (p>0. 05)。
[0341] 3. 5. 2复方银灵通胶囊对ADP诱导家兔体外血小板聚集率的影响
[0342] 表39体内给复方银灵通胶囊对ADP诱导家兔体外血小板聚集率的影响(1士义>
[0343]
[0344] *ρ〈0· 05, **ρ〈0· 01 vs.空白对照组；ap〈0. 05, aap〈0. 01 vs.银杏叶片组；bp〈0. 05， bbp〈0. 01 vs.阿司匹林组
[0345] 由表39可见，与空白对照组相比，银杏叶片组和阿司匹林组均能显著性抑制ADP 诱导的家兔体外血小板聚集（P〈〇. 05)，银灵通高、中、低三个剂量组对ADP诱导的家兔血小 板聚集有抑制作用，并随剂量升高，其聚集抑制率呈剂量依赖性升高，其中银灵通高剂量组 最大血小板聚集率与空白对照组比较有极显著性差异（P〈〇. 01)，银灵通中剂量组与空白对 照组相比有显著性差异（P〈〇. 05)。
[0346] 与阿司匹林组相比，银灵通高剂量组能显著性抑制ADP诱导的家兔体外血小板聚 集（p〈0. 05);银灵通其他各剂量组与阳性药组比较均无显著性差异（p>0. 05)。
[0347] 4、复方银灵通胶囊对血栓形成的抑制作用
[0348] 4. 1对大鼠颈动-静脉旁路丝线上血栓形成的影响
[0349] 取雄性SD大鼠60只，体重250~280g，将动物随机分为6组，每组10只，复方银 灵通胶囊 3 个剂量组，分别为：1. 2g/kg(0. 24g/ml)，0. 6g/kg(0. 12g/ml)，0. 3g/kg(0. 06g/ ml)。阳性对照药银杏叶片组4mg/kg(0. 8mg/ml)，阳性对照药2阿司匹林组30mg/kg(6mg/ ml)。阴性对照组（给以等容积的0.5%CMC-Na)。各组大鼠每日灌胃给药1次，连续给药 7日，给药容积为0.5ml/100g。
[0350] 末次给药后lh，大鼠用3 %水合氯醛溶液lml/lOOg ip麻醉，分离右颈总动脉及左 颈外静脉。在三段聚乙烯管中放入一根长约6cm的4号手术丝线。将生理盐水充满聚乙烯 管腔。先将管的一端插入左颈外静脉后，将管的另一端插入右颈总动脉。手术完成后开放 血流，则血液从右颈总动脉流经聚乙烯管，返回颈外静脉。开放血流15min后中断血流。迅 速取出带血块丝线称重得总重量，总重量减去丝线重即为血栓湿重。将丝线70°C烘干，取出 称重，总重量减去丝线重即为血栓干重。按下列公式计算抑制率 [12'13]:
[0353] 结果如下表所示。
[0354] 表40银灵通胶囊对大鼠颈动一静脉旁路丝线上血栓形成的影响(Y±S，n=10)
[0356] *p〈0. 05 **p〈0. 01 与空白对照组比较；ap〈0. 05, aap〈0. 01 vs.银杏叶片组； bp〈0.05，bbp〈0.01 vs.阿司匹林组
[0357] 由表40可见，与阴性对照组相比，银杏叶片、银灵通中、低剂量组能显著性降低 血栓湿重（P〈〇. 05)，阿司匹林组、银灵通高剂量组能极显著性降低血栓湿重（p〈0.01)，银 灵通高、中、低剂量对血栓湿重抑制率呈逐渐降低的趋势；银杏叶片、阿司匹林、银灵通高 剂量组均能极显著性降低血栓干重（P〈〇. 01)，银灵通中、低剂量能显著性降低血栓干重 (p〈0. 05)，银灵通高、中、低剂量对血栓干重抑制率呈逐渐降低的趋势。
[0358] 与阿司匹林组相比，银灵通中、低剂量组血栓干重均显著性增加（p〈0. 05);银灵 通其他各剂量组与阳性药组比较均无显著性差异（P>〇. 05)。
[0359] 4. 2对ADP致小鼠肺血栓形成的影响[14'15]
[0360] 取健康ICR小鼠60只，雌雄各半，体重19~22g，随机均分为5组，每组10只： 复方银灵通胶囊 3 个剂量组，分别为：2. 4g/kg(0. 12g/ml)，I. 2g/kg(0. 06g/ml)，0. 6g/kg (0. 03g/ml)。阳性对照药I银杏叶片组8mg/kg (0. 4mg/ml)，阳性对照药2阿司匹林组60mg/ kg(3mg/ml)。阴性对照组（给以等容积的0. 5% CMC-Na)。各组每日灌胃给药1次，连续给 药7日，给药容积为0. 4ml/20g。末次给药后lh，按200mg/kg尾静脉注射ADP，形成急性肺 血栓（小鼠呼吸喘促、不能自主活动），记录注射ADP后至小鼠恢复自主活动的时间。
[0361] 表41银灵通胶囊对ADP诱发小鼠急性肺血栓形成的影响（Y±S, n=10)
[0362]
[0363] *p〈0. 05 **p〈0. 01与空白对照组比较；ap〈0. 05, aap〈0. 01银灵通组vs.银杏叶片 组；bp〈〇. 05，bbp〈0. 01银灵通组vs.阿司匹林组
[0364] 由表41可见，与阴性对照组相比，银杏叶片组能极显著性缩短ADP致小鼠肺栓塞 恢复自主活动时间（P〈〇. 01)，银灵通高、中、低剂量均能显著性缩短ADP致小鼠肺栓塞恢复 自主活动时间（P〈〇.〇5)。
[0365] 与银杏叶片组相比，银灵通高剂量组恢复自主活动时间显著性延长（p〈0. 05)，银 灵通中、低剂量组恢复自主活动时间极显著性延长（P〈〇. 01);银灵通其他各剂量组与阳性 药组比较均无显著性差异（P>〇. 05)。
[0366] 5、复方银灵通胶囊对小鼠出血时间和凝血时间的影响
[0367] 5. 1对小鼠出血时间的影响
[0368] 取健康ICR小鼠60只，雌雄各半，体重19~22g，随机均分为6组，每组10只： 复方银灵通胶囊 3 个剂量组，分别为：2. 4g/kg (0. 12g/ml)，I. 2g/kg (0. 06g/ml)，0. 6g/ kg(0. 03g/ml)。阳性对照药I银杏叶片组8mg/kg(0. 4mg/ml),阳性对照药2阿司匹林组 60mg/kg(3mg/ml)。阴性对照组（给以等容积的0· 5% CMC-Na)。各组大鼠每日灌胃给药1 次，连续给药7日，给药容积为0. 4ml/20g。
[0369] 末次给药Ih后，将小鼠固定，以毫米尺测量鼠尾长度并标记，然后分别以利剪在 小鼠尾尖3mm处横断，待血液自行溢出，开始计时，每隔30s用滤纸吸去血滴1次，直至血液 自然停止（滤纸吸时无血）为止，即为出血时间 [16]。
[0370] 表42复方银灵通胶囊对小鼠断尾后出血时间的影响( X±S，η=1:0)
[0372] *ρ〈0· 05 **ρ〈0· 01 vs.空白对照组；ap〈0. 05, aap〈0. 01 vs.银杏叶片组；bp〈0. 05， bbp〈0. 01 vs.阿司匹林组
[0373] 由表42可见，与阴性对照组相比，阿司匹林组小鼠断尾后出血时间极显著性延长 (p〈0. 01)，银杏叶片、银灵通高剂量、中剂量组出血时间显著性延长（p〈0. 05)，其他组别与 阴性对照组相比无显著性差异（P>〇. 05)。
[0374] 与阿司匹林组相比，银灵通中、低剂量组出血时间显著性缩短（p〈0. 05);银灵通 其他各剂量组与阳性药组比较均无显著性差异（P>〇. 05)。
[0375] 5. 2对小鼠凝血时间的影响
[0376] 取健康ICR小鼠60只，雌雄各半，体重19~22g，随机均分为5组，每组10只： 复方银灵通胶囊 3 个剂量组，分别为：2. 4g/kg (0. 12g/ml)，I. 2g/kg (0. 06g/ml)，0. 6g/ kg(0. 03g/ml)。阳性对照药I银杏叶片片组8mg/kg(0. 4mg/ml)，阳性对照药2阿司匹林组 60mg/kg(3mg/ml)。阴性对照组（给以等容积的0· 5% CMC-Na)。各组每日灌胃给药1次， 连续给药7日，给药容积为0. 4ml/20g。
[0377] 末次给药Ih后，用毛细玻管自眼内眦插入，即有血液流出，并滴于载玻片上。每隔 15s用大头针自血液边缘向里轻轻拨动，观察有无血丝挑起。从采血开始到挑起血丝止，所 用时间即凝血时间 [17'18]。
[0378] 表43复方银灵通胶囊对小鼠凝血时间的影响（戈土S, ιι=!0)
[0380] *ρ〈0· 05 wp〈0. 01 vs.空白对照组；ap〈0. 05, aap〈0. 01 vs.银杏叶片组；bp〈0. 05， bbp〈0. 01 vs.阿司匹林组
[0381] 由表43可见，与阴性对照组相比，阿司匹林组能极显著性延长小鼠凝血时间 (P〈〇. 01)，银灵通高剂量组能显著性延长小鼠凝血时间（P〈〇. 05)，其他各组与阴性对照组 相比均无显著性差异（P>〇. 05)。
[0382] 银灵通各剂量组与阳性药组比较均无显著性差异（p>0. 05)。
[0383] 6、复方银灵通胶囊含药血清预防给药对体外培养皮层神经元的保护作用-机理 研究
[0384] 6. 1大鼠含药血清制备[19'2°]
[0385] SD大鼠24只，250g-300g，按体重随机分为阳性药1银杏叶片组26. 7mg/kg、阳性 药2阿司匹林组200mg/kg、银灵通组4g/kg，空白对照组，每组6只，灌胃给药，给药体积为 lml/100g，空白对照组给予等体积的0. 5% CMC-Na,每天给药两次，连续给药4天。最后一 次给药后lh，无菌颈总动脉取血，取血后室温静置2h，3000rpm离心20min，取上清液，将同 组血清混合，56°C灭活30min，超净台过滤除菌，分装保存于-80°C备用[21]。
[0386] 6. 2皮层神经元细胞原代培养
[0387] 根据Choi DW的方法略加改进，进行大鼠原代皮层神经元培养。取怀孕15-18天的 SD大鼠1只_，水合氯醛麻醉。用75%乙醇对母鼠腹部消毒，剪开腹腔，将胎鼠取出先放入 75 %乙醇中短暂浸泡消毒，再放入预冷的PBS中。在超净台中剪下胎鼠的头颅（从耳后剪）， 放入预冷的PBS中，将大脑全部取出放入预冷的PBS中。然后，将大脑皮层取下，去除脑膜， 将皮层剪碎后转移至离心管中。加入胰酶于37°C消化10分钟，每5分钟进行吹打混匀。加 入胎牛血清终止消化，然后继续吹打，再加入10% MEM培养基（每500mLMEM中含胎牛血清 50mL)吹打重悬。然后用100目筛网过滤，再用400目筛网过滤，转移滤液到干净离心管中离 心（10(K)rpm)5分钟。离心后弃去上清液，加入10%培养基吹打重悬。倒置显微镜下计数， 按照细胞密度I X IO6个/mL将细胞接种于预先用细胞粘附剂处理过夜的无菌培养板中，置 于37°C，CO2浓度为5%的无菌培养箱中孵育约4h，于显微镜下观察待细胞充分贴壁后，将 10% MEM培养基换成神经兀专用的维持培养基（Neurobasal Media 49mL+B27_Supplement ImL)幽。待细胞呈现神经元的形态即可用于实验[24' 25]。
[0388] 6. 3实验模型制备方法
[0389] 6. 3. 1连二亚硫酸钠（Na2S2O4)合并缺糖致皮层神经元细胞缺氧缺糖损伤模型（预 防给药）
[0390] 参照文献，稍加改进[26]，在无糖EBSS溶液中加入终浓度为IOmM的连亚二硫酸钠 (Na 2S2O4)干粉充分溶解，用NaHCO3调pH为7.2,即为缺氧溶液。此溶液需现用现配，为了消 除~ &2&04在水中分解产物的影响，除设空白对照组（对照组1)外，另设一非低氧溶液对照 组（对照组2)，非低氧溶液的配制是预先配制IOOmM的缺氧Na 2S2O4储备液，用时将储备液 (3天以上）稀释至10mM，即为IOmM Na2S2O4常氧溶液。
[0391] 设空白对照组（加入占总体积15%的空白对照组血清）、非低氧溶液对照组（加 入占总体积15%的空白对照组血清）、模型对照组（加入占总体积15%的空白对照组血 清）、阳性对照1银杏叶片组（加入占总体积15%的银杏叶片组含药血清）、阳性对照2阿 司匹林组（加入占总体积15%的阿司匹林组含药血清）和复方银灵通胶囊高（加入占总体 积15%的银灵通含药血清）、中（加入占总体积10%的银灵通含药血清+5%空白对照组血 清）、低（加入占总体积5 %的银灵通含药血清+10 %空白对照组血清）剂量组，每个剂量设 3个复孔，实验重复3次（MTT设6个复孔，实验重复3次）。取培养于24孔板生长良好的 皮层神经元细胞用于试验,加入各组血清,作用24h，弃去原液，用含糖的EBSS溶液轻轻荡 洗两遍，换成含有终浓度为IOmM的Na 2S2O4的无糖EBSS溶液培养Ih (空白对照组加入含糖 的EBSS)，同时用医用胶布将板四周封住，孵育Ih后换去缺氧培养液，用含糖的EBSS溶液轻 轻荡洗两次，换成正常含B-27 supplement的Neurobasal培养液，置37°C、5% CO2培养箱 内继续培养24h，形成缺氧/复氧损伤模型。
[0392] 6. 3. 2血小板活化因子（PAF)致皮层神经元细胞损伤模型（预防给药）[27]
[0393] 将皮层神经元细胞以IXlO6个/mL密度接种于24孔，置37°C，5% CO2培养箱中孵 育。每孔设空白对照组（加入占总体积15%的空白对照组血清）、非低氧溶液对照组（加 入占总体积15%的空白对照组血清）、模型对照组（加入占总体积15%的空白对照组血 清）、阳性对照1银杏叶片组（加入占总体积15%的银杏叶片组含药血清）、阳性对照2阿 司匹林组（加入占总体积15%的阿司匹林组含药血清）和复方银灵通胶囊高（加入占总体 积15%的银灵通含药血清）、中（加入占总体积10%的银灵通含药血清+5%空白对照组血 清）、低（加入占总体积5%的银灵通含药血清+10%空白对照组血清）剂量组，24孔板每 个剂量设3个复孔，实验重复3次。取培养第三天的皮层神经元细胞用于试验，弃去原培养 液，用PBS轻轻荡洗两次，加入各组血清培养24h后，弃去原培养液，用PBS轻轻荡洗两次， 加入新鲜培养液及终浓度为4X 10 5M的PAF，置37°C、5% CO2培养箱内继续培养48h。
[0394] 6. 4指标观察测定
[0395] 细胞形态学观察，MTT法测定细胞活力，LDH释放测定，LD含量测定，SOD活力测定， MDA含量测定均按照常规方法。
[0396] 6. 5实验结果
[0397] 6. 5. 1复方银灵通胶囊含药血清预防给药对连二亚硫酸钠（Na2S2O4)合并缺糖致 皮层
[0398] 神经元细胞缺氧缺糖损伤模型的影响
[0399] 细胞形态学观察：皮层神经元细胞经Na2S2O4处理约24h后，倒置显微镜下观察 ： 正常对照组细胞形态细长、透明度高、光泽较好；模型组细胞损伤明显。损伤的皮层神经元 细胞与正常细胞相比，细胞突起消失，肿胀，折光度减弱胞，胞质圆缩、脱落。加入银杏叶 片、阿司匹林、复方银灵通含药血清进行预保护的细胞与损伤细胞相比则形态明显改善，较 多细胞保留突起结构，肿胀细胞减少，而且细胞有光泽。
[0400] MTT法测定细胞活力
[0401] 表44银灵通含药血清预防给药对Na2S2O4造模后细胞存活率的影响护6)
[0403] cp〈0.05 rap〈0.01非低氧对照组与空白对照组比较；Ap〈0. 05 aaPWiOI模型 对照组与非低氧对照组比较；#P〈〇. 05、〈0. 01模型对照组与空白对照组比较；\〈0. 05 **p〈0. 01与模型对
[0404] 照组比较；ap〈0. 05, aap〈0. 01与银杏叶片组比较；bp〈0. 05, bbp〈0. 01与阿司匹林组 比较。
[0405] 由表44可见，与模型对照组相比，银杏叶片组、阿司匹林组、银灵通高、中剂量组 含药血清均能极显著性提高细胞存活率（P〈〇. 01)，银灵通含药血清对Na2S2O4合并缺糖造 成的皮层神经元细胞损伤模型OD 5wnni的保护作用随含药血清浓度的增加而增强。
[0406] 银灵通各剂量组与阳性药组比较均无显著性差异（p>0. 05)。
[0407] LDH漏出率测定细胞损伤程度
[0408] 表45银灵通含药血清预防给药对Na2S2O4造模后细胞LDH漏出率的影响 ：(χ：±δ? η=3)
[0411] ep〈0. 05 eep〈0. 01非低氧对照组与空白对照组比较；Αρ〈0. 05 ▲▲?〈0. 01模型 对照组与非低氧对照组比较；#Ρ〈〇. 05 ttttp〈0. 01模型对照组与空白对照组比较；、〈0. 05 wp〈0. 01与模型对照组比较；a