一种利用植物源活性物质拮抗多药耐药志贺氏菌的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，尤其设及一种石韦中提取的能括抗多药耐药志贺氏菌 的物质。
【背景技术】
[0002] 志贺氏菌属（捕也'eiia仍6祐iiani)属于革兰氏阴性杆菌，是引起人类细菌性频 疾的最常见的致病菌。由于抗生素的滥用，志贺氏菌属产生了广谱的耐药性。自20世纪50 年代，日本学者首次报道志贺菌对横胺类药物耐药W来，相继又出现了志贺菌对氯霉素、四 环素和氨节西林耐药的志贺菌株。近来，甚至又出现了对哇诺酬类、复方新诺明乃至超广谱 0-内酷胺类药物耐药的志贺菌株。2015年《华盛顿邮报》报道称，一种耐药性的索氏志贺 氏菌引起了美国马萨诸塞州、加利福尼亚和宾夕法尼亚州数次疾病暴发。运些地区的疾病 控制和预防中屯、发现，运=个州90%的实验病例都对抗生素环丙沙星具有耐药性。耐药志 贺菌已引起全球广泛关注，除了对四环素、氨节西林、横胺类药物耐药之外，对哇诺酬类尤 其是环丙沙星的耐药逐年增加，产P-内酷胺酶的耐药志贺菌对头抱菌素的敏感性下降； 在免疫低下的人群，耐药志贺菌对阿奇霉素的敏感性下降。志贺氏菌的耐药性已成为一大 难题，筛选新的药物刻不容缓。
[0003]有柄石韦（化从OO扣細?joefio知沉/曲化ri別)为水龙骨科（化从OO化sceae)石韦 属（兮rmsia)植物。具有利尿、通淋、清湿热之功效。临床上用于热淋、血淋、石淋、小便 不通，主治肺炎水肿、膀脫炎、泌尿系结石、尿血、崩漏、肺热喘咳。目前，石韦的利水通淋作 用已得到大量运用，但对其抗病毒、抗菌作用有待进一步开发研究。从目前我国对石韦的研 究来看，主要限于理论研究水平，缺少对石韦的开发利用。且目前抗生素多已产生了对应的 耐药菌，而植物源的抗菌物质则因为使用较少，鲜有相对的耐受菌。所W，植物源的抗菌物 质也是近年来的研究热点。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是制备一种能括抗多药耐药志贺氏菌的药物。
[0005] 本发明所提供的括抗多药耐药志贺氏菌的物质是从有柄石韦中提取出来的。本 实验中用到的志贺氏菌可耐受红霉素，庆大霉素，青霉素，四环素，克林霉素，新霉素等15 种抗生素。本发明人先分别用水，醇，乙酸乙醋=种溶剂浸提有柄石韦叶片，分别测定其抑 菌效果，发现石韦醋提物效果最好，能有效括抗多药耐药志贺氏菌的生长。石韦醋提物的 制备方法如下：首先对有柄石韦叶片进行预处理，弃去有虫蛙叶片，阴干至叶面含水量小于 5%，粉碎。称取IOkg粉碎后的石韦叶片，置于玻璃容器中，加入乙酸乙醋10化，浸提4她， 每隔2-4h缓慢振荡容器，对浸提液进行减压抽滤，另加I(K)L乙酸乙醋于滤渣中，合并两次 滤液。滤液通过旋转蒸发仪35-55°C浓缩至10L(含量为Ig/mL)，滤液经微孔膜化22ym) 过滤除菌备用。然后用QP2010气相色谱-质谱联用仪对有柄石韦醋提物进行成分分析，并 进行单乙酸甘油醋的成分分析。根据GC-MS的结果显示，石韦乙酸乙醋提取液中可检测到 28个峰（图I)，主要成分见表I。对检测到的成分进行分析，发现其主要为6类化合物，含 量较多的物质为醋类、糖巧类物质，其中单乙酸甘油醋在醋提物中占有较大比例，根据文献 分析推测单乙酸甘油醋在石韦醋提物中对于括抗多药耐药志贺氏菌有重要作用。遂用单乙 酸甘油醋进行试验分析，发现其能有效括抗多药耐药志贺氏菌的生长。最后用MIC和MBC 确定其最佳浓度，可W将之作为一种植物源的抗多药耐药志贺氏菌的物质。
[0006] 表1石韦醋提物GC-MS鉴定物质分类
[0007] 图I是石韦醋提物GC-MS分析色谱图 图2是单乙酸甘油醋试剂GC-MS分析图 图3是石韦乙酸乙醋醋提物GC-MS分析图 图4是单乙酸甘油醋质谱图 图5是单乙酸甘油醋试剂检测质谱图 图6是石韦醋提物检测质谱图 图7是观察石韦醋提物对志贺氏菌菌体形态影响的扫描电镜图 图7a空白对照组；图化乙酸乙醋处理组；图7c石韦醋提物处理组。
【具体实施方式】
[0008] 实施例子石韦醋提物括抗多药耐药志贺氏菌 1、石韦醋提物的制备 (1) 对有柄石韦叶片进行预处理，弃去有虫蛙叶片，阴干至叶面含水量小于5%，粉碎。 称量100g石韦粉末，将石韦粉末装在具塞容器中；然后加入IL乙酸乙醋，密封。浸提4她， 浸提过程中，每隔2-4h缓慢振荡烧杯，让浸取物充分溶解在乙酸乙醋中； (2) 将乙酸乙醋浸提过的石韦用布氏漏斗进行减压抽滤，得到乙酸乙醋粗提液物(醋提 物组分1)，置于密闭玻璃容器中； (3) 抽滤剩下的石韦残渣继续用IL的乙酸乙醋浸提； (4) 充分浸提后，再次用布氏漏斗抽滤，获得抽滤液体(醋提物组分2)，将两次抽滤的液 体混合，置于密闭玻璃容器中； (5) 将两次抽滤的液体置于旋转蒸发仪中，35-55°C旋蒸至IOOmL(含量为Ig/mL)，滤液 经微孔膜（0.22ym)过滤除菌备用。
[0009] 2、培养基的制备（LB培养基） 牛肉膏 3g;蛋白腺IOg;化ClSg;琼脂 18g;水 1000血；pH7. 0-7. 2 ;12rC灭菌 20min。
[0010] 3、用石韦醋提物括抗多药耐药志贺氏菌，使用抑菌圈法测定其抑菌效果，分别用 红霉素，庆大霉素，青霉素做对照。本实验中用到的志贺氏菌可耐受红霉素，庆大霉素，青霉 素，四环素，克林霉素，新霉素等15中抗生素。通过实验发现，石韦醋提物的抑菌圈直径为 14. 3mm，而红霉素，庆大霉素，青霉素无抑菌圈出现。
[0011] 4、通过MIC、MBC的测定W确定石韦醋提物括抗多药耐药志贺氏菌的最低抑菌浓 度 用96孔板法测定石韦醋提物的MIC和MBC从而测定其抑制多药耐药志贺氏菌的最 低浓度，实验W苯挫青霉素，链霉素，氨节青霉素，庆大霉素，红霉素，和单乙酸甘油醋的MIC 和MBC作为阳性对照实验。
[0012]
5、石韦醋提物对志贺氏菌菌体形态的影响 用石韦醋提物（MIC浓度，浓度为25mg/mL)处理志贺氏菌，并用乙酸乙醋处理志贺氏菌 作为阴性对照组，不加处理剂组做空白对照。然后用2. 5%戊二醒对志贺氏菌固定，再用梯 度乙醇脱水，送电镜室处理并观测结果。用电镜扫描空白对照组、阴性对照组W及石韦醋提 物处理后的志贺氏菌菌体，分别观察细胞形态，可见空白对照组细菌菌体形态完整，表面光 滑，细胞饱满，细胞间边界明显；乙酸乙醋处理组与空白对照相比，细菌不光滑，边界略显不 清，整体看与对照组无太大区别；石韦醋提物处理组菌体出现破损，具有明显的细胞原生质 体外泄现象，致使细胞结成团。
【主权项】
1. 从有柄石韦（Pyrrosialingua)中提取诘抗多药耐药志贺氏菌的植物源活性物质 的方法，其特征在于该方法包括以下步骤：对有柄石韦叶片进行预处理，弃去有虫蛀叶片， 阴干至叶片含水量小于5%，粉碎，称量100g石韦粉末置于玻璃容器中；然后加入1L乙酸 乙酯，密封，浸提48h，浸提过程中，每隔2-4h缓慢振荡容器；将浸提的石韦-乙酸乙酯液用 布氏漏斗进行减压抽滤，得到乙酸乙酯粗提液（酯粗提液组分1)，置于密闭容器中；抽滤剩 下的石韦叶残渣继续用1L的乙酸乙酯浸泡；充分浸提后，再次用布氏漏斗抽滤，获得抽滤 液体（酯粗提液组分2)，将两次抽滤的液体混合，置于玻璃容器中密闭保存；将两次抽滤的 液体置于旋转蒸发仪中，35-55°C旋转蒸发至100mL(含量lg/mL)，滤液经微孔膜（0. 22μm) 过滤除菌备用。2. 有柄石韦的乙酸乙酯提取物，水提物和乙醇提取物三种提取工艺所得物质中用乙酸 乙酯进行浸提得到的物质抑菌效果最好。3. 根据权利要求1所述的石韦酯提物，对其进行成分分析，其特征在于：GC-MS的结果 显示，石韦乙酸乙酯的提取液中检测到28个峰，对检测到的成分进行分析，发现其主要为5 类化合物，含量较多的物质为酯类、糖苷类物质，分别占总物质的18. 41%、21. 29%。4. 根据权利要求1所述石韦酯提物，对其进行单乙酸甘油酯成分检测，其特征在于：以 GC-MS检测单乙酸甘油酯试剂与石韦酯提物，其保留时间分别为7. 784min、7. 791min，保留 时间基本一致，质谱检测图谱与单乙酸甘油酯相一致，可初步说明石韦酯提液含有单乙酸 甘油酯。5. 根据权利要求1所得石韦酯提物对多药耐药志贺氏菌做抑菌实验，其特征在于：相 比常见抗生素如苯唑青霉素，链霉素等，石韦酯提物可见显著抑菌效果，MIC值为25mg/mL。6. 根据权利要求1所述得到石韦酯提物，用扫描电镜观察其对志贺氏菌形态的影响， 发现志贺氏菌出现细胞不饱满，原生质体外漏现象，说明石韦酯提物对志贺氏菌形态影响 较大。
【专利摘要】本发明公开了一种利用植物源活性物质拮抗多药耐药志贺氏菌的方法。本发明所提供的微生物拮抗剂是用乙酸乙酯从有柄石韦(Pyrrosia？lingua)中提取的。首先对有柄石韦叶片进行预处理，称取10kg处理后的石韦叶片，置于玻璃容器中，加入乙酸乙酯100L，浸提48h后对浸提液减压抽滤，另加100L乙酸乙酯于滤渣中，合并两次滤液。滤液通过旋蒸浓缩至10L(含量为1g/mL)，经微孔膜(0.22μm)过滤除菌备用。然后通过GC-MS对石韦酯提物进行成分分析。根据GC-MS的结果显示，石韦酯提物中可检测到28个峰。对检测到的成分进行分析，发现其主要为6类化合物。经实验验证，石韦酯提物能有效拮抗耐药志贺氏菌的生长，对开发新的拮抗志贺氏菌的药物有重要意义。
【IPC分类】A61P31/04, A61K36/11
【公开号】CN105343138
【申请号】CN201510725383
【发明人】赵建, 宋丽菊, 曹玫, 齐盼盼, 杨小帆, 安平, 王敏
【申请人】四川大学
【公开日】2016年2月24日
【申请日】2015年11月2日