占⑶4+T淋巴细胞的比例，每组各取5只小 ￡3邱U
[0049] 6. 1小鼠脾脏单细胞悬液的制备
[0050] (1)小鼠以10%水合氯醛腹腔注射麻醉后，浸入75%的酒精中10分钟，小鼠取右 侧卧位，逐层剖开腹腔，充分暴露脾脏，无菌条件下取出脾脏放入含有1%BSA的无菌培养 皿中，小心去除筋膜与脂肪组织，并用剪刀将脾脏分割成小碎块（1-2_);
[0051] (2)无菌50ml离心管上放置一无菌的40μπι无菌尼龙网，将分割完成的脾脏组织 置入其上，无菌滴管滴入1%BSA;
[0052] (3)用5ml的注射器内栓轻轻研磨脾脏，同时加入适量1 %BSA冲洗，至研磨充分， 共约10ml脾脏单细胞悬液；
[0053] (4)将离心管置于离心机中，调整离心条件：25°C，1200rpm，离心5min，轻轻弃去 上清；
[0054] (5)加入5_6ml红细胞裂解液并缓慢摇动使细胞重悬；
[0055] (6)室内静置4-5min，待红细胞裂解完成，加入10ml无菌PBS终止细胞裂解；
[0056] (7)加入 10ml1 %BSA后离心，25°C，1200rpm，离心lOmin，弃上清，加入 10ml1 % BSA，轻晃离心管，重悬细胞；
[0057] (8)静置 2-3min后，25°C，1200rpm，离心lOmin，弃上清，加入 700μ1 1%BSA，重 悬细胞；
[0058] (9)取10μ1单细胞悬液，行细胞计数；
[0059] (10)根据细胞计数结果调整细胞密度为5X106/ml。
[0060] 6. 2小鼠脾脏Thl和Thl7细胞的流式检测
[0061] 6. 2. 1刺激Thl和Thl7细胞因子分泌
[0062] (1)取无菌24孔板，每孔加100μ1上述脾脏单细胞悬液，900μ1配好的培养基， 0·5μ1lmg/mlΡΜΑ(终浓度为 500ng/ml)，0.5yllmg/ml离子霉素（终浓度为 500ng/ml)， 1μ1BFA(1μg/ml)，轻轻混勾，37°C无菌温箱培养4h。
[0063] (2)取出24孔板，轻轻混匀孔内液体，吸出至相应流式管中。
[0064] (3)将装有细胞悬液的流式管置于离心机中离心：25°C，2000rpm，3min，弃上清。
[0065] (4)加 2mlPBS重悬细胞，25°C离心 2〇OOrpm，3min，弃上清。
[0066] 6. 2. 2Thl和Thl7细胞胞外染色
[0067] (1)流式管标号，加入小鼠FITC-⑶4抗体，轻轻敲打混匀，室温避光孵育15min;
[0068] (2)加入lmlPBS混勾，2000rpm，25°C，离心 5min，弃上清；
[0069] (3)再次加入lmlPBS重悬，2000rpm，25°C，离心 5min，弃上清。
[0070] 6. 2. 3胞内染色
[0071] (1)各流式管中加入500μ1破膜剂，室温避光破膜20min;
[0072] (2) 25°C，350g，离心 5min，弃上清；
[0073] (3)各流式管中加入1ml破膜buffer(1X)，重悬细胞，25°C，350g，离心5min，弃上 清；
[0074] (4)用于Thl细胞染色的流式管中加入1μ1小鼠PE-IL-17抗体，用于Thl7细胞 染色的流式管中加入1μ1小鼠PE-IFN-γ抗体，轻轻敲打混匀，室温避光孵育20min;
[0075] (5)加入lmlPBS溶液，重悬细胞，置于离心机中离心，条件：25°C，350g，离心 5min，弃上清；
[0076] (6)重复上一步骤；
[0077] (7)加入500μ14%甲醛溶液固定细胞，4°C避光保存过夜；
[0078] (8) 25°C，350g，离心 5min，弃上清；
[0079] (9)加入500μ1鞘液重悬细胞，滤网过滤，上机检测分析。
[0080] 7实验结果
[0081] 7. 1甲氰咪胍干预下的小鼠眼底表现
[0082] 自小鼠免疫后的第12天起连续观察对照组及甲氰咪胍组所有小鼠眼底的发病情 况，并于免疫后第21天对小鼠进行眼底图片采集。图像显示对照组小鼠有明显的眼结膜炎 性渗出、血管炎及视乳头水肿（图1Α)，而甲氰咪胍组小鼠眼底未发现明显渗出、水肿或炎 性病变（图1Β)。甲氰咪胍组小鼠较对照组小鼠眼底炎症表现轻。
[0083] 甲氰咪胍组小鼠较对照组小鼠眼底炎症表现轻。免疫后第21天对小鼠进行眼底 图像采集。图1A显示，对照组小鼠眼底表现，可见明显的眼结膜炎性渗出，眼结膜血管炎， 视乳头水肿；图1B显示甲氰咪胍组小鼠眼底表现，眼结膜未见明显渗出，血管走形正常，视 乳头界限清楚
[0084] 7. 2甲氰咪胍干预下的临床评分
[0085] 依据患病小鼠临床评分标准于免疫后第21天对两组小鼠眼底情况进行临床评 分。如图2所示，甲氰咪胍组与对照组相比，临床评分显著降低。
[0086] 7. 3甲氰咪胍干预下的组织病理学评分
[0087] 依据患病模型临床评分标准对小鼠眼结膜HE染色切片进行组织病理学评分。如 图3所示，甲氰咪胍组与对照组相比，组织病理学评分显著降低。
[0088] 7· 4EB血管灌注造影眼结膜铺片结果
[0089] 对对照组和甲氰咪胍组小鼠分别进行眼结膜铺片，以评价甲氰咪胍对眼结膜血管 通透性及BRB完整性的作用。结果显示：对照组可见EB广泛而弥撒地自眼结膜血管向外渗 出（图4A)，而甲氰咪胍组小鼠的眼结膜血管走形正常，未见明显染料自血管渗出（图4B)。
[0090] 如图4A所示，对照组小鼠经伊文思蓝血管灌注循环2小时后，大量荧光染料自眼 结膜血管向外渗出。如图4B所示，甲氰咪胍组小鼠未见明显伊文思蓝染料外渗。
[0091] 7. 5流式细胞术检测小鼠脾脏辅助T淋巴细胞亚群结果
[0092] 流式细胞术是一种可以从功能水平上对细胞进行定量分析的新兴检测手段。采用 流式细胞术对对照组和甲氰咪胍组小鼠脾脏辅助T淋巴细胞亚群进行定量分析，探讨甲氰 咪胍对患病小鼠脾脏辅助T淋巴细胞亚群的影响。流式细胞术结果显示甲氰咪胍组小鼠 Thl细胞、Thl7细胞占单个核细胞群比例较对照组小鼠降低（图5A、B)。
[0093] 如图5所示，A.流式细胞术检测⑶4、IFN-γ标记小鼠脾脏Thl细胞群，甲氰咪胍 组较对照组显著降低。B.流式细胞术检测⑶4、IL-17标记小鼠脾脏Thl7细胞群，甲氰咪 胍组较对照组显著降低。
[0094] 综上所述，可以证明口服甲氰咪胍对自身免疫性结膜炎具有治疗作用，其治疗作 用是通过调节辅助T淋巴细胞亚群的不平衡，维持血眼结膜屏障的完整性，抑制眼内巨噬 细胞浸润实现的。
【主权项】
1. 式（I)化合物用于制备自身免疫性结膜炎治疗药物的应用，2. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述药物是W降低Thl淋己细胞含量为药 理作用的药物。3. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述药物是W降低化17淋己细胞含量为药 理作用的药物。4. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述药物是W抑制Thl淋己细胞分泌 IFN-T为药理作用的药物。5. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述药物是W抑制化17淋己细胞分泌 IL-17A为药理作用的药物。6. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述药物是W抑制眼结膜巨隧细胞浸润为 药理作用的药物。
【专利摘要】本发明提供了甲氰咪胍在制备自身免疫性结膜炎治疗药物中的应用。本发明创新性的发现甲氰咪胍可调节免疫系统效应，从而用于治疗相关病理损伤。具体而言，可下调Th1细胞亚群、Th17细胞亚群比例，维持血眼结膜屏障完整性，抑制巨噬细胞浸润，抑制眼内炎症反应。基于甲氰咪胍的以上新性质，本发明确定了利用其治疗结膜炎的新用途，临床应用发现，甲氰咪胍对自身免疫性结膜炎的治疗起效快、疗效确切，且未发现副作用，具有突出的推广前景。
【IPC分类】A61K31/4164, A61P37/02, A61P27/02
【公开号】CN105362265
【申请号】CN201510868349
【发明人】孙维星
【申请人】孙维星
【公开日】2016年3月2日
【申请日】2015年11月25日