多胜肽用于制造活体多效应的医药组合物的用图_3

文档序号:9606177阅读:来源:国知局
非另有说明,应指包 含一及一以上的数值。
[0053] 以下,为能更进一步说明本发明的多功效,将分别举实施例作详细说明,但是,这 些实施例为用以解说的例示,其中所使用的任何词汇并不限制本发明说明书及权利要求书 的范围及意义。另须先以叙明,下列实施例中的动物试验皆已获得中国医药大学动物保管 及使用委员会中的伦理委员会的同意。
[0054] 实施例一:制备氨基酸序列编码为SEQIDNo.1的多胜肽
[0055] 依据该发明所属技术领域且具通常知识者的一般知识,以固相合成法、或以重组 生物体产制平台、或及植物萃取等方法制备氨基酸序列编码为SEQIDNo. 1的多胜肽,其 中:
[0056] 以目前市面上的可自动合成多胜肽的装置,例如:固相胜肽合成仪、液相胜肽合 成仪、及微波胜肽合成仪等,皆可视需要选用以合成本发明所揭氨基酸序列编码为SEQID No. 1的多胜肽,如图2所示。
[0057] 通过重组生物体产制平台的方式,将含有能转录本发明所揭多胜肽的核酸的表现 载体置于一宿主细胞中,使该核酸分子在宿主细胞中表现氨基酸序列编码为SEQIDNo. 1 的多胜肽,如图3所示,其中,该宿主细胞可为大肠杆菌或酵母菌,且该表现载体可选自市 面上常见的载体,例如:pQStrep2、pQStrep4、pGEX_6pl、或pQTEV等。
[0058] 另以苦瓜为例,先以取得苦瓜萃取液,再以如蛋白质电泳纯化法或层析纯化步骤 等已知技术自该苦瓜萃取液中纯化取得本发明所揭多胜肽,另视需要添加防腐剂,如苯甲 酸钠或水杨酸等,并且将其置于_80°C下保存该多胜肽。而获得萃取液的步骤如下:首先, 在溶剂中将苦瓜离解(maceration)以得到一粗悬浮液,该溶剂可为磷酸盐缓冲液、柠檬 酸盐缓冲液、或水等,且可利用搅拌器或研磨器以离解苦瓜。接着,以12, 000转数/分钟 (revolutionperminute,rpm)至15, 000转数/分钟的离心转速,将粗悬浮液中的颗粒自 液相中移除,并以孔径为〇. 1微米至〇. 5微米的滤材来过滤上清液。然后,将所得的滤液依 序通过1千道尔顿(kDa)的滤膜,并取其上清液部分,以及10千道尔顿的滤膜,并取其滤液 部分,即可获得含有本发明所揭多胜肽的水溶性苦瓜萃取液,其中,该滤膜可选自已知滤材 产品,例如:Amicon滤膜及Millipore滤膜等。
[0059] 实施例二:多胜肽用于活体多部位、多基因靶点反应
[0060] 在本实施例中采用如下材料:
[0061] (A)实验对象:使用先以叙明,下列动物试验皆已获得中国医药大学动物保管及 使用委员会中的伦理委员会的同意。使用FVB品系的小鼠以进行实验,此等小鼠均由国家 实验动物中心(NationalLaboratoryAnimalCenter)所提供。
[0062] (B)多胜肽:使用实施例一中所制得氨基酸序列编码为SEQIDNo. 1的多胜肽。
[0063] 将FVB品系小鼠均分为对照组和实验组两组,给予实验组的小鼠每只含有2. 5毫 摩尔/公斤体重(mm〇l/kg)的本发明所揭氨基酸序列编码为SEQIDNo. 1的多胜肽溶液 (20微升),连续七天;而对照组,则给予每只小鼠20微升的磷酸盐缓冲液。试验结束后,将 各该组小鼠的空肠、肌肉、脂肪、肝脏、肾脏等组织取出后,利用系统生物学进行多器官、多 靶点分析。由于本发明所属技术领域且具通常知识者周知通过DNA微阵列可观测到全基因 体上受调控的基因种类,也可进一步利用生物资讯软件分析影响及作用的路径为何,因此, 将进一步以微阵列与基因表现图谱来进行机制的探究,以观察受本发明所揭氨基酸序列编 码为SEQIDNo. 1的多胜肽影响的基因。兹详细说明操作流程如下:
[0064] ( 一)RNA样品以RNeasyMinikit(Qiagen,Valencia,CA,USA)进行细胞total RNA的萃取。接着,利用BeckmanDU800 分光光度计(BeckmanCoulter,Fullerton,CA,USA) 进行totalRNA的定量,A260/A280比值大于1.8的样品,进一步利用Agilent2100 bioanalyzer(AgilentTechnologies,SantaClara,CA,USA)评估其totalRNA的品质。只 有当样品的RNAintegritynumber高于8.0时,才会用于下述的微阵列实验分析。
[0065](二)DNA微阵列实验分析。DNA微阵列实验分析方法如Cheng等(2007)报告中 所述。简言之,将totalRNA(5yg)先利用MessageAmp?aRNAkit(Ambion),经由试管内转 录(invitrotranscription)的步骤加以放大。放大的RNA(amplifiedRNA,简称aRNA) 再和Cy5染剂进行化学反应,并将Cy5染剂标定到aRNA上,使得aRNA成为带有荧光标定 的标的物。荧光标定完成后,利用盖玻片和华联公司所提供的杂交缓冲剂(hybridization buffer),将焚光标定的标的物与WholeGenomeOneArrayTM进行杂交。在50°C经过一夜的 杂交之后,通过三个清洗步骤将非专一性结合的标的物从晶片上清除。接着将晶片以离心 的方式使其干燥,并利用Axon4000 扫描器(MolecularDevices,Sunnyvale,CA,USA)进 行焚光强度的扫描。我们使用genepix4. 1软件(MolecularDevices)对晶片上每一点的 Cy5荧光强度进行分析。每一点的讯号经由扣除周围背景值的方式校正其强度。我们删除 作为内在控制的探针(probe)或是信噪比(signal-to-noiseratio)小于零的点。通过这 些门滥的点通过R程式的limmapackage进行归一化(normalization) (Smyth, 2005) 〇
[0066](三)利用生物资讯软件分析作用机制及影响路径。利用生物资讯软件,例如: 医学主题词表(MedicalSubjectHeadings,MeSH)(http://www.nlm.nih.gov/mesh/meshhome.html)、BiblioSpherePathwayEdition软件等分析表现有差异的基因的作用机 制、影响的路径及与疾病的关联度。
[0067] 各路径所得的分析结果如下表一所示,由表一的结果可知,本发明所揭氨基酸序 列编码为SEQIDNo. 1的多胜肽确实能在个体的不同部位、不同基因靶点进行反应,并且影 响讯息传递路径及疾病。
[0068] 表一:在不同部位影响各路径或疾病的基因的分析结果
[0069]



[0073] 实施例三:多胜肽用于治疗发炎或含有发炎反应的病症
[0074] 在本实施例中,分别就动物活体内的荧光影像测定、动物活体外的荧光影像测定、 免疫组织染色分析进行确效,其中,采用如下材料:
[0075] (A)实验对象:将受细胞核因子-κB(NF_κB)调控的荧光素酶(Luciferase,luc) 基因转殖鼠与野生型小鼠F1进行交配,产生具有FVB遗传特性的NF-κB/luc异型合子基 因转殖小鼠以进行实验。
[0076] (B)多胜肽:使用实施例一中所制得氨基酸序列编码为SEQIDNo. 1的多胜肽。 [0077](一)动物活体内的荧光影像测定
[0078] 将6~8周龄的雌性基因转殖鼠,共15只,随机均分为三组,其中,第一组为空白 组;第二组为对照组;第三组为实验组。以腹腔注射的方式,给予第二组及第三组的各该小 鼠含有4毫克/公斤体重的脂多糖体发炎反应诱发物质(lipopolysaccharide;LPS)溶液 (100微升),而给予第一组中的各该小鼠100微升的磷酸盐缓冲液。5分钟后,给予第三组 中的各该小鼠含有〇. 5毫克/公斤体重的该多胜肽溶液,20微升,而给予第一组及第二组 中的各该每只小鼠20微升的水。四小时后,分别以活体影像观察各该组小鼠的荧光素酶活 性。
[0079] 详言之,先以腹腔注射的方式,给予各该组中的各该小鼠含有150毫克/公斤体重 的荧光素(luciferin)。5分钟后,分别以异氟烷将各该组小鼠麻醉,并且各该组小鼠腹部 朝上置于IVIS影像系统 200 系列(IVISImagingSystem_200SeriesXenogen,Hopkinton, ΜΑ)的照相舱内,将照相机设定为最高敏感度进行成像1分钟。以生活影像软件(Living Ima
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