有机自由基DPPH(1, 1-二苯基-2-苦基苯肼，1，1-diphenyl-2-picryl hydrazyl)的还原反应（抗氧化剂氧化）而产生的吸光度变化来评价抗氧化能力的方法。 抗氧化程度通过测定DPPH的氧化受到抑制而吸光度相比对照组减少的程度，以相对于对 照组吸光度显示出50%以下的吸光度的浓度（IC5。）评价为有效抗氧化浓度。
[0070] 在190μ1的100μΜ(溶于乙醇）DPPH溶液中分别混合10μ1的实施例1的绿茶 种子提取物、实施例2至5的21-0-当归酰茶皂醇Ε3及对照试样而准备了反应液。使混合 的反应液在37°C下反应30分钟，然后在540nm处测定吸光度。对照试样使用广泛被用作合 成抗氧化剂的水溶性维生素E(Trolox)。对各自的DPPH分析结果表示在下表1中。
[0071] 表 1
[0072]
[0073] 从上表1的结果可以知道，21-0-当归酰茶皂醇E3具有非常优异的抗氧化能力，与 公知的抗氧化剂水溶性维生素E相比，抗氧化能力更优异。
[0074] [实验例2]利用焚光物质来进行活性氧簇（reactiveoxygenspecies;R0S)的 生成抑制能力实验
[0075] 用于试验的细胞系为人角质形成细胞HaCaT细胞系（HumankeratinocytesHaCaT cellline)，将其以每孔2.OxlO4个的量接种在荧光测定用96孔黑板上，使用添加了青霉 素 / 链霉素的DMEM(DulbeccosModificationofEaglesMedium，FBS10% )培养基，并 在37°C、5%C02条件下培养1天后用试验试样来进行处理。分别使用50ppm的实施例1的 绿茶种子提取物、实施例2至5的21-0-当归酰茶皂醇E3及对照试样作为试验试样，对照 试样使用了被广泛用作合成抗氧化剂的水溶性维生素E。然后使用添加了青霉素/链霉素 的无血清DMEM(不含FBS)作为培养基，在37°C、5%C02条件下培养1天。
[0076] 添加实验试样培养 24 小时后，用HCSS(HEPES-bufferedcontrolsalt solution(羟乙基哌嗪乙硫磺酸-缓冲控制盐溶液））洗涤，从而去除剩余的培养基， 在HCSS中添加100μ1已准备好的20yMDCFH-DA(2'，7'_二氯二氢代荧光素二乙酸酯 (2,，7'-dichlorodihydro_fluoresceindiacetate)，分子探针有限公司（Molecular Probes，Inc))，然后在37°C、5%C02条件下培养20分钟，用HCSS洗涤。之后，加入用试样 处理的100μ1的HCSS，然后利用荧光光谱仪（Ex= 485nm，Em= 530nm)测定初期氧化为 R0S的DCF(二氯荧光黄，dichlorofluorescein)的荧光度。之后照射紫外线（UVB) (30mJ/ cm2)，利用荧光光谱仪（Ex= 485nm，Em= 530nm)测定刚处理之后或经过3小时后的荧光 度。
[0077] 将使用二甲基亚砜（DMS0)的情况作为对照组，以此为基准求得各个试验物质的 R0S生成抑制能力（对照组的％ )，实验结果示于下表2。
[0078] 表 2
[0079]
[0080] 从上表2的结果可以知道，21-0-当归酰茶皂醇E3的R0S生成抑制能力优异，与公 知的抗氧化剂水溶性维生素E相比，抑制R0S生成的能力更优异。
[0081] [实验例3]利用小鼠色素细胞的黑色素生成的抑制效果测定
[0082] 将源自C57BL/6 小鼠的鼠色素细胞（Mel-Abcell) (Dooley，Τ·P.etal，Skin pharmacol，7，pp188-200)在于DMEM中添加了 10%胎牛血清、lOOnM12-0-十四烷酰佛波 醇（tetradecanoylphorbol)-13_ 醋酸酯、InM霍乱毒素（choleratoxin)的培养基中，在 37°C、5%C02条件下培养。将培养的Mel-Ab细胞用0. 25%的胰蛋白酶-EDTA剥离，以105 + 细胞/孔的浓度在24孔板中培养，从第2天开始连续3天添加10ppm的各试验试样。试验 试样使用实施例1的绿茶种子提取物、实施例2-5的21-0-当归酰茶皂醇E3及对照试样， 对照试样使用了作为公知的美白剂的对苯二酚作为阳性对照组，将没有处理试验试样的作 为阴性对照组。添加试验试样后，在37°C、5%C02条件下培养1天，然后去除培养基液，并 用PBS洗涤，然后用1N氢氧化钠溶解细胞，在400nm处测定吸光度。将测定的结果根据下 述数学式1计算出黑色素生成抑制率，其结果示于下表3 (杜利（Dooley)的方法）。
[0083] 数学式1
[0084] 黑色素生成抑制率（％)= 100-(各试验物质的吸光度/阴性对照组的吸光 度）X100
[0085] 表 3
[0086]
[0087] 从上表3可以确认，21-0-当归酰茶皂醇E3显示出优异的黑色素生成抑制率，与公 知的美白剂对苯二酚相比，显示出更优异的黑色素生成抑制率。
[0088] [试验例4]对人体皮肤的皮肤美白效果实验
[0089] 为了确认上述实施例4中获得的21-0-当归酰茶皂醇E3对人体皮肤的皮肤美白 效果，进行了如下实验。
[0090] 首先，以12名健康男性为对象，在受试人员的上臂部位粘贴带有直径为1. 5cm的 孔的不透明胶带，然后对受试人员的上臂照射最小红斑量（MinimalErythemaDose)的 1. 5~2倍程度的紫外线（UVB)，诱导皮肤的黑化。
[0091] 照射紫外线后，分别涂抹1 %的实施例4-1的21-0-当归酰茶皂醇E3(溶剂为 1，3-丁二醇：乙醇=7 :3)、1 %对苯二酚和1 %溶剂（对照组（vehicle))(阴性对照组），另 外一处是没有涂抹任何东西的状态下，观察了状态变化10周。以1周为单位，利用色差仪 CR2002(日本，美能达公司）测定皮肤色泽变化。
[0092] 然后根据下述数学式2计算出上述各试验物质涂覆开始时点和涂覆完成时点的 皮肤色差（AL*)，将此示于下表4中。另外，美白效果通过试样涂抹部位和对照组部位的 ΛL*比较来判断，ΛL*值为2左右时，为对沉淀色素的美白化明显的情况，1. 5以上时可判 断为具有美白效果。
[0093] 数学式2
[0094] ΛL* =涂抹完成时点的L*值-涂抹开始时点的L*值
[0095] 表 4
[0096]
[0097] 从上表4的结果可以确认，21-0-当归酰茶皂醇Ε3使肤色提亮，显示出与公知的 美白剂对苯二酚相似的肤色提亮程度。这可以判断为本发明中使用的21-0-当归酰茶皂醇 Ε3通过改善由紫外线生成的色素沉积，从而提亮肤色。
【主权项】
1. 含有下述化学式I所示的21-0-当归酷茶皂醇E3作为有效成分的抗氧化用皮肤外 用剂组合物： [化学式1]2. 含有下述化学式1所示的21-0-当归酷茶皂醇E3作为有效成分的皮肤美白用皮肤 外用剂组合物： [化学式1]3. 根据权利要求1或2所述的皮肤外用剂组合物，其中，W组合物总重量计，含有 0.OOOl~10重量％的所述21-0-当归酷茶皂醇E3。4. 根据权利要求1或2所述的皮肤外用剂组合物，其中，所述21-0-当归酷茶皂醇E3 源自绿茶种子。5. 根据权利要去4所述的皮肤外用剂组合物，其中，所述21-0-当归酷茶皂醇E3是利 用酸、碱、酶或生产上述酶的微生物分解绿茶种子提取物而得。6. 含有下述化学式1所示的21-0-当归酷茶皂醇E3作为有效成分的的皮肤外用剂组 合物在用于抗氧化方面的应用： [化学式1]7.含有下述化学式I所示的21-0-当归酷茶皂醇E3作为有效成分的的皮肤外用剂组 合物在用于皮肤美白方面的应用： [化学式1]
【专利摘要】本发明涉及一种含有源自绿茶种子的21-O-当归酰茶皂醇E3成分作为有效成分的抗氧化或皮肤美白用组合物，更具体地，涉及一种含有通过利用酸、碱、酶或生产上述酶的微生物的分解反应，从绿茶种子提取物中获得的源自绿茶种子的21-O-当归酰茶皂醇E3成分作为有效成分，从而具有优异的抗氧化及皮肤美白效果的组合物。
【IPC分类】A61K36/82, A61P17/00, A61K31/56
【公开号】CN105377263
【申请号】CN201380078158
【发明人】朴晙成, 沈晋燮, 黃景焕, 姜永圭, 朴俊镐, 廉明勋, 曹浚喆
【申请人】株式会社爱茉莉太平洋
【公开日】2016年3月2日
【申请日】2013年7月11日
【公告号】WO2015005512A1