表型相 似，所以我们详细研究了D品系。
[0039] 转基因小鼠脂肪重量减少的原因可能是脂肪发育障碍，也可能是脂代谢障碍。我 们首先检测了棕色和白色脂肪组织的DNA含量，并未发现显著差异（图1G)。与此一致，白色 脂肪组织中脂肪分化相关分子标记的检测也无明显变化，说明miR-378过表达对脂肪分化 没有显著影响（图1H)。接着我们检测了脂代谢情况。HE染色结果显示转基因小鼠的白色和 棕色脂肪中核密度明显升高（图II-图1J)，棕色脂肪中解偶联蛋白l(Ucpl)、过氧化物酶体 增殖物激活受体(Ppary )、PgC-la、PgC-10表达也都明显上调（图1K)。以上数据表明，转基 因小鼠脂肪重量减少主要由于脂肪组织中脂类分解代谢增强。
[0040] 实施例2:miR-378转基因小鼠显示能量缺乏
[0041] 为进一步确定转基因小鼠脂肪重量减少是由于能量需求导致的分解代谢增强引 起，我们用代谢笼实验测定了转基因小鼠和野生型对照小鼠的代谢状况。转基因小鼠的氧 消耗和二氧化碳产生都显著高于野生型对照小鼠（图2A-图2B)，食物摄取和饮水也显著升 高（图2C-图2D)。另外，转基因小鼠的热量产生也高于野生型对照小鼠（图2E)，这与其Ucpl 的高表达是一致的（图2F)。这表明转基因小鼠能量代谢受损，在正常生理条件下需要增强 分解代谢来供应机体需求。
[0042] 糖脂代谢在调节能量稳态方面具有重要作用。我们随后直接测定了脂肪和骨骼肌 组织的糖脂代谢情况。我们首先测定了脂肪组织的脂代谢，发现在转基因小鼠的白色脂肪 中，脂解基因 ATGL、HSL、CGI-58的表达均显著升高（图2G)，提示其脂解增强。我们还发现其 甘油水平升高（图2H)，进一步证明转基因小鼠白色脂肪中脂肪分解加快，支持脂解增强。另 外，我们还观察到在棕色脂肪和骨骼肌中，脂解和脂肪酸利用的相关基因表达都上调（图 21-图2J)，而相应地，血清中游离脂肪酸(FFA)水平下降（图2K)。以上数据说明转基因小鼠 脂肪分解代谢显著增强。总之，这些证据表明，转基因小鼠脂解增强，代谢活跃，分解产生的 脂肪酸被利用导致血清中游离脂肪酸水平下降。
[0043] 我们接下来检测了转基因小鼠的糖代谢状况。实验表明，转基因小鼠在饥饿条件 下血糖显著高于野生型对照小鼠（图2L)，提示转基因小鼠糖代谢异常。对10周龄小鼠的糖 耐量检测表明，转基因小鼠糖耐量受损（图2M)。而接下来的胰岛素耐量检验表明转基因小 鼠未发生胰岛素抵抗（图2N)，并且其血清胰岛素水平也无异常（图20)。丙酮酸耐量测试表 明转基因小鼠糖异生明显增加（图2P)，而磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶表达水平也升高（图 2Q)。以上数据表明，转基因小鼠糖代谢紊乱，导致整体能量耗竭。血糖升高是由于糖代谢平 衡失调，而不是因为胰岛素分泌不足或胰岛素抵抗。
[0044] 结论:转基因小鼠的代谢紊乱引起能量缺陷。
[0045] 实施例3:miR-378转基因小鼠抵抗饮食诱导的肥胖
[0046] 接下来我们检测了转基因小鼠是否因为能量缺陷而抵抗饮食诱导的肥胖。6周龄 雄性转基因小鼠采用高脂饲料喂养8周，称重。我们发现转基因小鼠体重显著低于同样高脂 饲料喂养的野生型对照小鼠（图3A)，转基因和野生型对照小鼠高脂饲料喂养时的食物摄取 量没有区别（图3B)。高脂饲料喂养的野生型对照小鼠脂肪重量明显增加，而转基因小鼠脂 肪重量的增加显著低于野生型对照小鼠（图3C)，脂肪细胞数量也显著低于野生型对照小 鼠（图3D)。转基因小鼠的棕色脂肪和白色脂肪细胞直径明显小于野生型对照小鼠，脂肪细 胞内的脂滴大小明显小于野生型对照小鼠（图3E和3F)。高脂饲料喂养后，野生型对照小鼠 会出现明显的GTT和ITT异常，我们观察到转基因小鼠的GTT(图3G)和ITT(图3H)得到显著改 善。
[0047] 结论:转基因小鼠对饮食诱导的肥胖有抵抗作用。
[0048] 实施例4:miR-378可以预防和改善小鼠的肥胖
[0049] 转基因小鼠对肥胖的抵抗提示我们miR-378可以预防小鼠的肥胖。为此，通过尾静 脉给高脂饲料喂养的小鼠注射agomiR-378,每周一次，持续8周。结果发现，注射agomiR-378 的肥胖干预组小鼠在体重和体重增长方面都显著小于对照组小鼠（图4A)。有趣的是，过表 达miR-378的小鼠棕色脂肪重量并未减少，而白色脂肪(包括iWAT和gWAT)的增重都明显减 少（图4B)。这与其脂肪细胞体积显著缩小是一致的（图4C)。肝脏和骨骼肌重量无明显变化。 接下来我们检测了miR-378对糖耐量和胰岛素抵抗的影响。注射agomiR-378的肥胖干预组 小鼠表现出显著改善的GTT(图4D)和接近正常的ITT(图4E)。这些结果说明miR-378可以预 防高脂饮食诱导的肥胖。
[0050] 接下来我们每周通过尾静脉给高脂饮食诱导的肥胖小鼠注射agomiR-378进行治 疗，持续4周。实验结束时，注射agomiR-378的治疗组小鼠体重显著低于对照组，体重增长也 显著降低（图4F)。特别是白色脂肪重量比对照组降低了 31%，而棕色脂肪重量无显著变化 (图4G)，脂肪细胞体积和脂肪重量也都减小（图4H)。与此一致，治疗组小鼠的GTT(图41)和 ITT(图4J)也都明显改善。
[0051] 结论:通过转基因或药物过表达miR-378可以预防和治疗小鼠的肥胖。
[0052] 实施例5:骨骼肌中的丙酮酸-磷酸烯醇式丙酮酸无效循环导致小鼠能量缺陷 [0053]骨骼肌的糖代谢对于维持代谢稳态，调节机体能量平衡非常重要。我们发现，转基 因小鼠骨骼肌中糖代谢的缺陷很可能是其整体代谢失调的根本原因。为此，我们直接测定 了小鼠骨骼肌中糖酵解活性，发现转基因小鼠糖酵解显著增强。转基因小鼠的糖酵解关键 酶基因：己糖激酶2(Hk2)、磷酸果糖激酶I(Pfkl)和丙酮酸激酶(Pk)表达显著升高（图5A)， α_磷酸甘油脱氢酶活性也显著增强，相比之下，氧化代谢相关的琥珀酸脱氢酶(SDH)活性显 著降低（图5Β)。由于转基因小鼠糖酵解代谢活跃，我们进一步检测了糖酵解的产物丙酮酸。 有趣的是，我们没有发现转基因小鼠骨骼肌组织中丙酮酸积累增加，反而发现其丙酮酸水 平下降（图5C)。我们检测了丙酮酸脱氢酶(PDH)活性，进一步排除了 PDH异常的可能（图f5D)。
[0054] 生化上的无效循环是由于两个方向相反的代谢反应同时高速进行引起，其结果是 消耗能量产热。例如，糖酵解时由磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)产生丙酮酸，丙酮酸又经丙酮酸 羧化酶(PC)和磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶(PEPCK)重新生成PEP，这一循环的结果是净消耗 1个ATP。因为转基因小鼠糖酵解增强，而丙酮酸水平没有升高，所以我们推测丙酮酸又生成 了 PEP。我们在转基因小鼠的骨骼肌中发现PC和PEPCK的mRNA(图5E)和酶活性（图5F)都显著 升高，提示转基因小鼠骨骼肌中发生了丙酮酸-磷酸烯醇式丙酮酸无效循环。与此相一致， 我们还观察到转基因小鼠骨骼肌中乙酰辅酶A浓度显著下降（图5G)。总之，转基因小鼠骨骼 肌中丙酮酸-磷酸烯醇式丙酮酸无效循环导致小鼠能量相对不足，骨骼肌组织ATP水平下降 (图 M0。
[0055] 我们前面发现转基因小鼠的能量缺陷可以被高脂饮食弥补，并且过表达miR-378 可以预防高脂饮食诱导的肥胖。接下来我们检测转基因小鼠骨骼肌中丙酮酸-磷酸烯醇式 丙酮酸无效循环是否可以被高脂饮食减弱。实验证明，转基因小鼠在高脂饲料喂养后PEPCK 的表达几乎恢复到了野生型对照小鼠的水平（图51)。综上所述，转基因小鼠骨骼肌中丙酮 酸-磷酸烯醇式丙酮酸无效循环导致的小鼠糖代谢缺陷至少是其能量缺陷的部分原因，它 导致了脂肪组织中脂解增强，可能是整体能量缺陷的起因。
[0056] 实施例6 :miR-378通过Akt-FoxOl-PEPCK途径激活丙酮酸-PEP无效循环
[0057]有报道miR-378可以调控Aktl Jktl是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，在胰岛素通 路与其他通路的相互作用上起着重要调控作用。Aktl基因敲除小鼠的表型与miR-378的转 基因小鼠相似，如体重和脂肪重量降低，代谢紊乱等。我们观察到转基因小鼠骨骼肌中Aktl 蛋白水平明显降低（图6A)。转录因子FoxOl是Aktl的直接底物，被磷酸化后会调控改变代谢 平衡。而PEPCK的转录恰好被FoxOl调控。显然，miR-378可以通过Akt-FoxOl-PEPCK途径激活 丙酮酸-PEP无效循环。我们检测了转基因小鼠骨骼肌中FoxOl的蛋白水平和磷酸化水平，发 现磷酸化的失活FoxOl明显减少（图6A)，即转基因小鼠骨骼肌中去磷酸化的FoxOl更多，就 导致转基因小鼠 PEPCK表达上调。
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